Eksperimentuokite, kad bakteriofagas būtų kultivuojamas ir skaičiuojamas

Eksperimentuokite, kad bakteriofagai būtų auginami ir išvardyti!

Principas:

Bakteriofagui jautrių bakterijų suspensija (virusas, kuris užkrečia bakterijas) yra sėkloje su bakteriofagu ir leidžiama augti kaip susiliejanti veja ant agaro plokštės.

Bakteriofago dalelės auga bakterijų ląstelėse ir jas lizuoja. Bakterijų ląstelių lizė lemia aiškių zonų susidarymą bakterijų susiliejusioje veja. Šios aiškios zonos vadinamos „plokštelėmis“. Manoma, kad kiekviena aiški zona yra sudaryta iš vienos bakteriofago dalelės. Taigi, plokštelių formavimo vienetų (PFU) skaičius rodo bakteriofago skaičių.

Serijinis praskiedimo metodas naudojamas bakteriofagų, panašių į tuos, kurie naudojami skaičiuojant bakterijas, skaičiavimui. Mėginyje esančių faginių dalelių skaičius nustatomas skaičiuojant plokštelių, susidariusių ant sėklų agaro plokštelės, skaičių ir dauginant jį iš praskiedimo faktoriaus.

Norint nustatyti galiojantį fagų skaičių, plokštelių skaičius plokštelėje neturi viršyti 300 ir ne mažesnis kaip 30. Plokštelės, kuriose yra daugiau nei 300 PFU, vadinamos „per daug, kad būtų galima suskaičiuoti“ (TNTC), o plokštelės, kuriose yra mažiau nei 30 PFU, vadinamos „per mažai skaičiuoti“ (TFTC).

Reikalingos medžiagos:

Tryptono sultinys, minkštas agaras, triptonas, kietas agaras, kūginė kolba, mėgintuvėliai, sterilizuoti Petri lėkštelės, medvilnės kamščiai, bakteriofago auginimo kultūra (Ex: T 2 kolipagė), bakterijų maistinių medžiagų sultinio kultūra (pvz. sterilizuotos pipetės, autoklavas, karšto vandens vonios, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indas, inkubatorius.

Procedūra:

1. Penkiolika pipetės (nerūdijančio plieno pipetės dėkle) ir penki Petri lėkštelės sterilizuojamos karšto oro orkaitėje 180 ° C temperatūroje 3 valandas. Arba jie gali būti padengti amatų popieriumi, susietu su sriegiu arba gumine juosta ir sterilizuoti autoklave kartu su terpė (8.3 pav.).

2. Tryloninės sultinio terpės arba jo paruoštų miltelių, reikalingų 100 ml sultinio, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje. Naudojant 0, 1 N HCl arba 0, 1 N NaOH, jo pH nustatomas iki 7, 5. Kolba prireikus kaitinama, kad visiškai ištirptų ingredientai.

3. Sultinys pasiskirsto į 10 mėgintuvėlių (kiekvienas 9 ml), užsukamas medvilnės, padengtas amatų popieriumi ir sujungtas su sriegiu arba gumine juosta.

4. Tryloninės minkštos agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje. Naudojant 0, 1 N HCl arba 0, 1 N NaOH, jo pH nustatomas iki 7, 5. Kolba sušildoma, kad būtų visiškai ištirpintas agaras.

5. Ši skystoji terpė yra paskirstoma į 5 mėgintuvėlius (po 2 ml), užsukti į medvilnę, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta.

6. Tryptono kietosios agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje, šildant po pH koregavimo iki 7, 5. Kolba yra su medvilniniu kamščiu, padengta amatų popieriumi ir sujungiama su sriegiu arba gumine juosta.

7. 10 triptono sultinių mėgintuvėliai, 5 tryptono minkštieji agaro mėgintuvėliai ir kolba, kurioje yra sunkiosios agaro terpės, sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

8. Kūginėje kolboje sterilizuota triptono kietoji agaro terpė aseptiškai supilama į 5 sterilizuotus Petri lėkšteles, kad gautų 5 tirpalo kietos agaro plokštelės.

9. Viena ml bakteriofago pradinės kultūros (Ex: T2 kolipagas) aseptiniu būdu, geriau laminarinio srauto kameroje, steriliu pipete įpilama į triptono sultinio mėgintuvėlį (9 ml). Tai tampa 10 kartų praskiedimu (ty 10 -1 ). Tai aseptiškai nuosekliai praskiedžiama į kitus devynis sultinio mėgintuvėlius, kad gautų galutinį skiedimą 10–10 (8.4 pav.).

10. Imami 5 sterilizuoti triptono minkšti agaro vamzdžiai ir kaitinami vandens vonioje iki 100 ° C, kad būtų ištirpintas agaras. Vamzdžiai atšaldomi ir išlydytos minkštos minkštos lemputės palaikomos 45 ° C temperatūroje.

11. Iš pirmiau minėtų 10 mėgintuvėlių, turinčių skirtingų koncentracijų fagus, parinkti penki mėgintuvėliai (ty 10-5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 ir 10 -9 ). Iš šių mėgintuvėlių aseptiškai 1 ml perkeliami į penkis triptono minkštus agaro mėgintuvėlius, naudojant atskiras sterilizuotas pipetes.

12. Du lašai bakterijų maistinių sultinių kultūros (pvz., Escherichia coli B) aseptiškai perkeliami, pageidautina į laminarinę srauto kamerą, į kiekvieną triptono minkštą agaro mėgintuvėlį, kuriame yra bakteriofagas penkiose skirtingose ​​koncentracijose ( 10–10–9 ).

13. Penkių triptono minkštųjų agaro mėgintuvėlių, turinčių bakteriofagą ir bakterijas, turinys greitai maišomas sukant tarp delnų.

14. Turinys aseptiškai supilamas į penkias triptono kietas agaro plokšteles, paženklintas 10-5 - 10 -9, taip sudarant dvigubo sluoksnio plokštelės kultūros preparatą. Plokštelės švelniai sukasi ir sukietėja.

15. Plokštelės inkubuojamos inkubatoriuje apverstoje padėtyje 37 ° C temperatūroje.

Pastabos:

1. Visos plokštelės stebimos plokštelių formavimo vienetų (PFU), kurie išsiskiria kaip aiškios zonos ant bakterijų vejos.

2. Fagų skaičiavimui atsižvelgiama tik į tas plokšteles, kurių PFU yra tarp 30 ir 300. Skaičiuojamas kiekvieno plokštelės PFU skaičius. Plokštelės, kuriose yra daugiau nei 300 PFU, yra vadinamos „per daug, kad būtų galima suskaičiuoti“ (TNTC), o lėkštės, kuriose yra mažiau nei 30 PFU, yra vadinamos „per mažai skaičiuoti“ (TFTC). Tokios plokštės nelaikomos.

3. Remiantis stebėjimais, bakteriofagų skaičius viename fagų fagų kultūros ml skaičiuojamas pagal šią formulę.

Fagų skaičius / ml = PFU X praskiedimo faktoriaus skaičius

Pavyzdžiui, jei PFU kiekis yra 280, kai praskiedimas yra 10-7, fagų skaičius fagų atsargų kultūroje yra 280 x 107 fag / ml (= 2, 80 X109 fag / ml).