3 svarbiausi polimerazės grandinės reakcijos (PCR) etapai

Toliau pateikiami trys polimerazės grandinės reakcijos (PCR) etapai. Nuoseklieji žingsniai yra: Denatūravimas 2. Iškaitinimas 3. DNR išplėtimas.

Eilės žingsnis # 1. Denatūravimas:

Pirmasis žingsnis yra DNR denatūravimas (tiek pradmenų DNR, tiek ir natūralios DNR). Dviejų DNR krypčių atskyrimas yra žinomas kaip denatūravimas, o du stendai kartu vadinami pakartotiniu anuliavimu arba hibridizacija (48.1 pav.). Marmoras ir Lane (1960 m.) Dirbtinai sukūrė DNR denatūravimą ir pakartotinį anuliavimą.

Jų teigimu, dvigubos DNR gali būti atskirtos į dvi atskiras grandines (denatūravimą), kaitinant aukštoje temperatūroje (90–95 ° C) ir hibridizuojant arba sujungiant dvi DNR grandines (dvigubos DNR), kuri yra įmanoma. mažinant temperatūrą (50-56 ° C).

Tai yra pagrindinis PCR funkcijų principas. Antrasis principas yra pradmenų išplėtimas DNR polimerazės fermento pagalba.

Natūrali DNR, gruntas ir DNR polimerazės fermentas (Tag polimerazė) įdedamas į PCR mėgintuvėlį ir temperatūra pakeliama ir nuleista PCR mašinoje, kad denatūruotų ir hibridizuotų.

Sekvencinis žingsnis # 2.

Denatūravus DNR, kitas žingsnis yra leisti sintezės pradmeniui susimaišyti su priešingomis norimos sekos DNR sritimis. Jei temperatūra nuo 95 ° C yra sumažinta iki 50/56 ° C, gali pasireikšti kvėpavimas (hibridizacija). Tuomet mašina sumažina temperatūrą.

Kai tik temperatūra bus sumažinta, natūralios DNR juostos susieja ne tik viena kitą, bet ir prijungia pradmenis. Šis specifinis papildomų nukleotidų hibridizavimas arba „rekombinacija“ suteikia pagrindą ir praktinį pagrindą daugeliui rekombinantinės DNR (48.2 pav.).

Žingsnis # 3. DNR išplėtimas (reikalingas Taq polimerazės fermentas):

Po to, kai pradmenys yra sušvelnę, jie turėtų būti pratęsti naudojant pradinę oligonukleotido pradmenį. aprašyta, kad DNR sintezei reikalinga fermento DNR polimerazė. Todėl, norint išplėsti gruntą, mums reikia termiškai stabilios DNR polimerazės, kad fermentas nebūtų sunaikintas aukštoje temperatūroje.

Termo stabili polimerazė (Taq polimerazė) yra izoliuota iš Thermus aquaticus. Taq polimerazė turi didžiulį pranašumą atliekant PCR reakciją. Jo optimali aktyvumo temperatūra yra apie 70 ° C, o švieži fermentai po šildymo ir aušinimo proceso nereikia pridėti į kiekvieną mėgintuvėlį.

Termo stabilią DNR polimerazę dabar gamina skirtingos įmonės, turinčios skirtingus šaltinius (išskyrus Thermus aquaticus) skirtingais prekybos pavadinimais (TM). Gruntui pratęsti, į vamzdelį pridedama termiškai stabili DNR polimerazė, o temperatūra pakyla iki 65-70 ° C.

Vėlesni juostos atskyrimo ciklai (denatūravimas), grunto hibridizacija (atkaitinimas) ir juostos sintezė (pratęsimas) užtikrina eksponentinį tikslinių sekų amplifikavimą naudojant sustiprintą seką, jei ankstesnis ciklas yra naujas šablonas, yra trys ciklai (48.2 pav. ).

Gruntų gamyba:

Gruntai yra trumpos sekos (dažnai RNR) yra naudojamos dviejų nukleotidų gamybai, vadinamiems pradmeniu, su kiekvienu DNR fragmento galu ir suteikia laisvą 3-OH galą, kuriame DNR polimerazė pradeda dezoksiribonukleotidinės grandinės sintezę.

Viena seka yra sukurta prasmės kryptimi, o kita - antisensine kryptimi. (Pav. 48.2). Gruntas naudojamas papildomų DNR grandinių sintezei užpildyti ir suprojektuotas taip, kad DNR tarp pradmenų būtų amplifikuotinas dominuojantis fragmentas.

Jei stiprinamasis RNR (mRNR) yra amplifikuotas, jis turi būti konvertuojamas į nemokamą DNR (cDNA) pagal RNR priklausomą DNR polimerazę, atvirkštinę transkriptazę. Tada cDNR kompleksas keičiamas į dvigubą DNR, tapdamas šablonu vėlesnei PCR reakcijai.

Tai dažnai vadinama atvirkštine transkriptazės polimerazės grandine (RT PCR). Gruntai gali būti gaminami dirbtinai arba gali būti įsigyti iš įmonių.

Baigus reakciją, amplifikuoti produktai (DNR) gali būti vizualizuojami gelio elektroforezės būdu. Svarbi DNR molekulės fizinė savybė yra ta, kad kiekvienas atskiras nukleotidas turi neto neigiamą įkrovą, gautą iš fosfato grupės.

Taigi skirtingo dydžio elektromagnetiniam laukui paveikti fragmentai linkę judėti link teigiamo elektrodo skirtingu greičiu, priklausomai nuo dydžio, o mažos fragmentai migruoja greičiau nei didesnis. Šis atskyrimo procesas, pagrįstas elektros krūviu, vadinamas elektroforeze.

Po to, kai restrikcijos fermentas (endonukleazė) suardomas į skirtingo dydžio fragmentus, DNR mėginiai pridedami prie pagalbinės terpės, pvz., Agrėsgelio arba akrilamido. Gelio poros priklauso nuo jo procentinės dalies ir gali būti lyginamos su (molekuliniu) sietu. Taigi, DNR fragmentų migracijos greitis per gelį priklauso nuo DNR fragmento dydžio ir taikomos įtampos.

Konkrečių DNR fragmentų atskyrimo ir išskyrimo procedūra yra Southern blotting. Šio metodo svarba yra ta, kad vienagrandės fragmentas gali būti perduodamas kapiliariniu būdu į kietą pagrindinę terpę (nailono arba celiuliozės membraną) ir pastoviai pritvirtintą kaitinant (48.3 pav.).

Po elektroforezės DNR modelis gali būti vizualizuojamas UV lempoje po apdorojimo etidžio bromidu. etidžio bromidas yra fluorescencinis dažiklis. Agro gelio elektroforezė išskyrė fragmentus iš 100 bazinių porų iki 60000 bazinių porų (60 kb), o poliakrilamido geliai efektyviai atskiria fragmentus nei 1000 bazinių porų (1 kb).

Impulsinio gelio elektroforezė (PFGE) leido atskirti DNR fragmentus net iki 2kb. Šioje procedūroje elektrinis laukas keičiamas skirtingomis kryptimis, priverčiant DNR molekules perorientuoti tarp kiekvieno impulso arba elektros srovės. Tai geriausias būdas nustatyti žinomą geną.

Endonukleazės gali atpažinti 3, 4, 5, 6 arba 8 bazines poras ir yra prieinamos rinkoje.

PCR buferiai / druskos.

Taq DNR polimerazei buferis gaminamas taip:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCI kambario temperatūroje

Dimetilo sulfoksidas (DMSO) ir glikolis yra naudojami kaip pagalbinis tirpiklis PCR buferiuose, kai taikinys turi labai aukštą denatūracijos temperatūrą.

Deoksinukleotidų trifosfatas (dNTP) yra jonų kofaktoriai.

Dabar biotechnologijos įmonės teikia paruoštus sprendimus.

Pagrindinis principas apibūdinamas taip:

Yra keturi dNTP, ty dATP (adenino trifosfatas), dCTP (citozinas), dGTP (guninas), dUTP (uracilas), kurie naudojami pagal bazinių porų taisykles, norint išplėsti gruntą ir galiausiai nukopijuoti tikslinę seką.

DNTP jungiasi su Mg ²⁺ . Reakcijoje esančių dNTP kiekis nustatys laisvo Mg ²⁺ kiekį, esantį optimaliam fermento aktyvumui. Ištekliai dNTP tirpalai turi būti neutralizuoti Tris baze iki pH 7, 0, o jų koncentracija turėtų būti nustatyta spektrofotometriškai.

Substratas ir substrato analogai:

Taq polimerazė veikia labai efektyviai (dNTP). Tačiau vietoj Tag DNA polimerazės substrato yra keletas modifikuotų substratų. Jie yra dogoksigenin-dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP ir fluorescenciją žymintys dNTPS.

Visuotinai naudojami šie PGR tipai:

(1) nested PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Inkarų PGR;

(4) asimetrinė PCR;

(5) atvirkštinė PCR;

(6) DOP-PCR.