Oksidazės tyrimas su bakterijomis, siekiant išsiaiškinti jų gebėjimą oksiduoti sumažintą citochromą C

Perskaitykite šį straipsnį, kad sužinotumėte apie bakterijų oksidazės testą, kad sužinotumėte jų gebėjimą oksiduoti sumažintą citochromo C:

Principas:

Kai kurios bakterijos gali oksiduoti „sumažintą citochromo C“, esančią jų ląstelėse, į „oksiduotą citochromo C“, nes jie gali sukelti fermentą „citochromo oksidazę“.

Oksiduotas citochromo C gamina violetinę spalvą (Wurster purpurinį) su dažų N-tetrametil-para-fenilendiaminu (ty oksidazės reagentu).

Atliekant oksidazės testą, maistinių agarinių plokštelių, kuriose yra bandomosios bakterijos, kolonijos yra užtvindytos oksidazės reagento tirpalu. Jei bakterijos turi galimybę gaminti citochromo oksidazę, kolonijų spalva plokštelėse pasikeičia į violetinę. Jei bakterijos nesugeba gaminti citochromo oksidazės, kolonijos išlaiko pirminę rožinę oksidazės reagento spalvą.

Reikalingos medžiagos:

Petri lėkštelės, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, platinos vielos inokuliavimo kilpa, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indelis, inkubatorius, Whatman filtravimo popieriaus juostelė, oksidazės reagentas (N-tetrametil-para-fenilendiaminas) maistinių agarų, izoliuotų kolonijų arba grynos bakterijų kultūros.

Procedūra:

a) plokštelės metodas:

1. Išvalomi du Petri lėkštelės, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta (7.19 pav.). Šie etapai, taip pat ir Petri lėkštelių sterilizavimas 6 žingsnyje yra praleidžiami, jei sterilizuoti orkaitėje sterilizuoti Petri lėkštelės yra naudojami tiesiogiai.

2. Maistinių agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje.

3. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 0, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudojant 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis.

4. Kolba visiškai pašildoma, kad agaras būtų visiškai ištirpintas.

5. Kolba yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungiama su sriegiu arba gumine juosta.

6. Du Petri lėkštelės ir kūginė kolba, kurioje yra maistinių agaro terpės, sterilizuojamos 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Po sterilizavimo jie pašalinami iš autoklavo ir tam tikrą laiką leidžiama atvėsti, neleidžiant terpei kietėti. Medžiagos aušinimas neleidžia kondensuotis ir kauptis vandens lašeliuose plokštelėse. Jei laikymo metu terpė jau buvo paruošta ir sukietėjusi, ji turi būti suskystinta atsargiai, kol visiškai ištirps.

8. Norint paruošti maistinių agaro plokšteles, prieš sterilizuotą maistinę agaro terpę atvėsinant ir kietinant, šiltoje išlydytoje aplinkoje jis įpilamas aseptiškai, pageidautina laminarinio srauto kameroje, į du sterilizuotus Petri lėkšteles (maždaug 20 ml). išlydyta terpė visiškai uždengia Petri lėkštelių dugną.

Tada plokštės yra padengtos dangteliais ir leidžiama atvėsti, kad jose sukietėtų terpė. Vandens garai, kurie gali kondensuotis ant plokščių ir dangčių vidinio paviršiaus, išgarinami, laikant plokšteles ir dangtelius apverstoje padėtyje inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje maždaug 1 valandą.

9. Kiekviena plokštė apatinėje pusėje yra pažymėta keturiais ketvirčiais.

10. Bandomųjų bakterijų „inokuliacija“ atliekama aseptiškai, pageidautina laminarinio srauto kameroje, kiekvieno ketvirčio centre, padarytais bakterijų tašku (arba mažu tepalu), naudojant liepsnos sterilizuotą kilpą. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

11. Inokuliuojamos plokštelės inkubuojamos inkubatoriuje, kol bakterijos kolonijos yra matomos 24 valandas inkubatoriuje, apverstoje padėtyje, žemyn.

12. Plokštelės užtvindomos oksidazės reagentu.

b) popieriaus metodas:

1. 1% oksidazės reagente įmerkta „Whatman“ filtro popieriaus juosta džiovinama ir laikoma tamsoje.

2. Prieš naudojimą, jis sudrėkinamas ir bandomosios bakterijos kilpa padedama vietoje kaip platinos vielos kilpa. Nichromo kilpa gali oksiduoti reagentą. Todėl reikia naudoti platinos kilpą.

3. Taškas stebimas po 10 sekundžių.