Eksperimentas, skirtas išsiaiškinti bakterijų gebėjimą dekarboksilinti įvairias amino rūgštis (su paveikslu)

Eksperimentuokite, kad sužinotumėte bakterijų gebėjimą dekarboksilinti skirtingas aminorūgštis!

Principas:

Kai kurios bakterijos geba dekarboksiluoti skirtingas aminorūgštis į atitinkamus aminus ir CO _2, nes jie gali gaminti atitinkamus „aminorūgščių dekarboksilazės“ fermentus.

Tarp jų kiekviena bakterija gali dekarboksilinti tik kai kurias aminorūgštis, nors ji negali dekarboksilinti kitų.

Taigi, aminorūgštys, kurias bakterijos gali dekarboksilinti, ir aminorūgštys, kurios negali būti bakterijų savybės. Atliekamas aminorūgščių dekarboksilazės testas, siekiant atskirai išbandyti bakterijų gebėjimą dekarboksilinti aminorūgštis, pavyzdžiui, liziną, ornitiną ir argentiną, gaminant C02 ir atitinkamus aminus, tokius kaip kadaverinas, putrescinas ir agmatinas.

Jei bakterijos gali

dekarboksilina bet kurią vieną ar daugiau aminorūgščių, gamina atitinkamus aminus, kurie yra šarminiai (baziniai), ir todėl padidina bromo kreolio violetinės spalvos pasikeitimą nuo geltonos iki violetinės.

Aminorūgščių dekarboksilazės bandyme bandomosios bakterijos auginamos anaerobiškai sultinio terpėje, kurioje yra gliukozės, bromkrezolio violetinės ir vienos iš aminorūgščių. Sultinio spalva iš pradžių nuo violetinės iki geltonos spalvos pasikeičia dėl pH sumažėjimo dėl rūgščių, gautų fermentuojant gliukozę. Jei bakterijos geba dekarboksilinti aminorūgštį, sultinio spalva pasikeičia nuo geltonos iki purpurinės.

Reikalingos medžiagos:

Mėgintuvėliai, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, inokuliacinė kilpa, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indas, inkubatorius, amino rūgščių dekarboksilazės sultinys, amino rūgštys (lizinas, ornitinas, argininas), skystas parafinas, izoliuotos kolonijos arba grynos kultūros bakterijų.

Procedūra:

1. Aminorūgščių dekarboksilazės sultinio terpės ingredientai (kurių pagrindiniai komponentai yra gliukozė ir bromkrezolis) arba jo paruošti milteliai, reikalingi 400 ml sultinio, pasveriami ir ištirpinami 400 ml distiliuoto vandens 500 ml kūginėje kolboje. kratant ir sukant (7.11 pav.).

2. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir sureguliuojamas iki 7, 2, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudoja 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis. Kolba prireikus kaitinama, kad visiškai ištirptų ingredientai.

3. 400 ml sultinio yra paskirstoma į keturias 250 ml kūgines kolbas, kad kiekvienoje kolboje būtų 100 ml sultinio.

4. Trims iš šių kolbų atskirai pridedamos trys aminorūgštys, pvz., Lizinas, ornitinas ir argininas (po 0, 5 gramo), o viena laikoma be aminorūgščių, kad būtų naudojama kaip kontrolė. Kontrolė naudojama atskiriant dviejų pakopų spalvos pakitimus bandomojoje terpėje (ty nuo violetinės iki geltonos spalvos ir nuo geltonos iki purpurinės).

5. Keturių kūginių kolbų sultiniai skirstomi į keturis atskirus mėgintuvėlių rinkinius (maždaug po 10 ml), prijungtus prie medvilnės, padengtus amatų popieriumi ir susietus su sriegiu arba gumine juosta.

6. Sultinio mėgintuvėliai sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Sultinio mėgintuvėliams leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros.

8. Skystas parafinas sterilizuojamas kaitinant 180 ° C temperatūroje 3 valandas karšto oro orkaitėje.

9. Bandomosios bakterijos aseptiškai inokuliuojamos, geriausia laminarinėje srauto kameroje, į sultinį, naudojant inokuliacinę kilpą, sterilizuotą bunseno liepsna. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

10. Sterilizuotas skystas parafinas švelniai pilamas aseptiniu būdu į inokuliuojamus mėgintuvėlius (apie 1 cm aukščio ant terpės), kad būtų užtikrinta anaerobinė būklė.

11. Inokuliuoti sultinio mėgintuvėliai inkubuojami inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje ir stebimi kasdien, kol bandymas yra teigiamas arba ne ilgiau kaip 4 dienas.