Išbandytas bakterijų gebėjimas hidrolizuoti amino rūgšties triptofaną (su paveikslu)

Išbandant bakterijų gebėjimą hidrolizuoti amino rūgšties triptofaną!

Principas:

Kai kurios bakterijos gali hidrolizuoti amino rūgšties triptofaną į indolą, nes jie gali gaminti fermentą „triptofanazę“.

Tryptofanas hidrolizuojamas gaminant indolą, piruvino rūgštį ir amoniaką. Indolis aptinkamas spalviniu reagentu, paradimetilaminobenzaldehidu (p-DMAB, ty Kovac reagentu), kuris gamina rausvą žiedą. Indolis reaguoja su p-DMAB, kad gautų junginį „chinoidinis raudonas violetinis junginys (rosindolio dažiklis)“, kuris yra rožinės spalvos. Žiedas gaminamas paviršiuje, nes reagentas yra paruošiamas amilo alkoholiu.

Indolo tyrime bandomosios bakterijos auginamos sultinėje, kurioje yra triptofanas. Jei bakterijos gali hidrolizuoti triptofaną į indolą, pridedant p-DMAB, sultinio kultūros paviršiuje susidaro rožinis žiedas.

Reikalingos medžiagos:

Mėgintuvėliai, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, inokuliavimo kilpa, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indas, inkubatorius, triptono sultinys, Kovac reagentas (paradimetilaminobenzaldehidas), izoliuotos kolonijos arba grynos bakterijų kultūros.

Procedūra:

1. Tryloninės sultinio terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml sultinio, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje. Tryptonas veikia kaip triptofano šaltinis. Todėl triptofano pridėjimas į sultinį yra neprivalomas (7.3 pav.).

2. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 5, naudojant 0, 1 N HC1, jei jis yra didesnis arba naudojamas 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis. Kolba prireikus kaitinama, kad visiškai ištirptų ingredientai.

3. Sultinys pasiskirsto į penkis mėgintuvėlius (maždaug 5 ml), užsukti į medvilnę, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta.

4. Sultinio mėgintuvėliai sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

5. Sultinio mėgintuvėliams leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros.

6. Bandomosios bakterijos aseptiškai inokuliuojamos, geriau laminarinės srauto kameros, į sultinį, naudojant inokuliacinę kilpą, sterilizuotą bunseno liepsna. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

7. Inokuliuoti sultinio mėgintuvėliai inkubuojami inkubatoriuje 48 valandas 37 ° C temperatūroje.

8. Spalvinis reagentas, para-dimetilaminobenzaldehidas (p-DMAB) (ty Kovac reagentas) nuleidžiamas į sultinio mėgintuvėlius (po 0, 5 ml) ir stebimas po 1 minutės.

Arba:

7. Oksalo rūgštyje įmirkytos popierinės juostelės dedamos į inokuliuojamų sultinių mėgintuvėlius, todėl maždaug pusė popierinių juostelių lieka vamzdžių viduje, neliesdami sultinio, o kita pusė lieka išorėje. Tam filtravimo popierius supjaustomas maždaug 35 mm ilgio ir 5 mm pločio juostelėmis. Juostelės mirkomos karštu vandeniniu vandeninio oksalo rūgšties tirpalu ir išdžiovinamos prieš naudojimą.

8. Inokuliuoti sultinio mėgintuvėliai inkubuojami inkubatoriuje 48 valandas 37 ° C temperatūroje.