Bakterijų auginimas iš kietų, skystų ir tamponų mėginių (su paveikslu)

Tikslas:

Pagrindiniai bakterijų auginimo tikslai yra šie:

1. Padidinti bakterijų skaičių, kad jie būtų matomi, kolonijos ar suspensijos.

2. Bakterijų išskyrimas.

3. Grynų išteklių kultūros ir standartinių kultūrų palaikymas.

4. Bakterijų skaičiavimas mėginiuose.

5. Konkrečių bakterijų, kurias domina mėginys, nustatymas ir jo skaičiavimas.

6. Bakterijų identifikavimas iš kolonijų savybių, augimo charakteristikų, esančių grioveliuose ir biocheminėje veikloje skirtingose terpėse.

Tačiau šio eksperimento tikslas yra auginti bakterijas iš skystų, kietų ir paviršinių mėginių kietose ir skystose terpėse, kad jos būtų matomos kaip kolonijos arba suspensija.

Principas:

Bakterijos yra kultivuojamos sterilizuotoje, maistingai turtingoje skystoje arba kietoje terpėje. Skystos terpės, vadinamos sultiniu, yra bandomuosiuose mėgintuvėliuose, siekiant sudaryti „sultinio mėgintuvėlius“, o kietos terpės, vadinamos agaro terpėmis, yra Petri lėkštelėse, kad susidarytų „agaro plokštės“ arba tiesiog „plokštės“. Bakterijų auginimui reikalinga medžiaga, kuri, kaip įtariama, turi bakterijų.

Dauguma dalykų, kuriuos matome, turi bakterijų. Jie yra dantų grandinėse, maisto produktuose, dirvožemyje, vandenyje, išmatose ir pačioje sterilizuotoje mikrobiologinėje terpėje. Tam tikras kiekis bet kurios bakterijos turinčios medžiagos homogeninės suspensijos aseptiškai inokuliuojama į sterilizuotą terpę ir inkubuojamas inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 24 valandas.

Skystame sultinyje bakterijos auga kaip suspensija ir tampa drumstos. Ant kietų agaro plokštelių jie auga kaip kolonijos; kiekviena kolonija auga iš vienos bakterijos. Bakterijų auginimas atliekamas penkiais etapais.

1. Medijų paruošimas

2. Medijų ir stiklo dirbinių sterilizavimas

3. Inokuliacija

4. Inkubacija

5. Stebėjimas

1. Medijos paruošimas:

Paprastai ruošiant skystą sultinį ir pusiau kietąsias medžiagas sudedamosios dalys pasveriamos nustatytomis proporcijomis ir ištirpinamos reikiamame vandens kiekyje. Šiuo metu yra paruoštų terpių miltelių, kurių sudėtyje yra reikalingų proporcijų.

Ruošiant skystą sultinio terpę, nustatytas kiekis miltelių (kaip nurodyta pakuotės etiketėje) pasveriama ir ištirpinama reikiamame vandens kiekyje kūginėje kolboje. Sudedamosios dalys ištirpinamos pašildant, supilamos į mėgintuvėlius ir sterilizuojamos autoklave.

Tačiau ruošiant kietas plokštes, griovelius ir gilius vamzdžius, nustatytas kiekis miltelių (kaip nurodyta pakuotės etiketėje) yra pasveriamas ir ištirpinamas reikiamame vandens kiekyje kūginėje kolboje. Ši paruošta terpė pirmiausia sterilizuojama autoklave ir po to tam tikrą laiką leidžiama atvėsti.

Vis dar šilta, prieš kietinant, ji pilama į sterilizuotus Petri lėkšteles arba mėgintuvėlius ir leidžiama sukietėti atšaldant iki kambario temperatūros. Labai karšta terpė niekada neturėtų būti supilama į talpyklas, nes dėl to ant konteinerių sienos susidaro vandens kondensatas, kuris nukrenta ant terpės paviršiaus ir gali sukelti jo užteršimą.

2. Sterilizavimas:

Stiklo paketai sterilizuojami karšto oro orkaitėje 180 ° C temperatūroje 3 valandas ir terpė autoklave 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių. Stiklo paketai taip pat gali būti sterilizuojami autoklave, tačiau terpė niekada neturėtų būti sterilizuojama orkaitėje, nes vanduo išsilieja iš terpės ir jie dehidratuoja.

3. Inokuliacija:

Manoma, kad skysti mėginiai yra homogeninės bakterijų suspensijos. Todėl, auginant sultinyje, aseptiškai į sultinį pipete įpilama tam tikro tūrio. Auginant ant agaro plokštelių, tam tikras mėginio tūris pipetuojamas ant kietos agaro plokštės ir aseptiškai paskleidžiamas į terpės paviršių.

Kietiems mėginiams, tam tikro svorio mėginys aseptiškai homogenizuojamas tam tikru tūrio normaliu fiziologiniu tirpalu (0, 85% natrio chlorido), naudojant sterilizuotą šepetėlį ir skiedinį arba maišytuvą. Dauguma žmogaus patogenų yra izotoniniai žmogaus organizmui (0, 85% natrio chlorido).

Paprastai mėginio ir fiziologinio tirpalo santykis yra 1: 9 (1 g + 9 ml; 10g + 90 ml; 25g + 225 ml arba 50 g + 450 ml). Tam tikras šio homogenizuoto skysčio tūris, kuris, kaip manoma, yra homogeniška bakterijų suspensija, yra sterilizuojamas į sterilizuotą sultinį sultinio kultūros mėgintuvėliuose. Kultūrai ant agaro plokštelių skysta suspensija yra pipetuojama ant plokščių paviršiaus ir paskleidžiama aseptiškai.

Paviršiaus mėginiams, paimtiems tiriant kietų paviršių (stalviršių, kūno paviršių ar žaizdų) mikrobiologiją, paviršius trinamas sterilizuotu tamponu. Tepalas paliesta sterilizuoto agaro plokštės paviršiaus. Nuo palietimo taško sterilizuota kilpa yra aseptiniu būdu, kad būtų išskirtos bakterijos.

4. Inkubacija:

Inokuliuoti sultinio mėgintuvėliai ir plokštės inkubuojami inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 24 valandas.

5. Stebėjimas:

Drumstumas skystame sultinyje ir kolonijose ant agaro plokštelių rodo bakterijų augimą.

Reikalinga medžiaga:

Petri lėkštelės (6 nos.), 2 ml pipetės (5 nos.), Mėgintuvėliai (5 nos.), Kūginės kolbos (100 ml, 250 ml ir 500 ml-l), 250 ml stiklinė (2 nos.), Stiklas barstytuvas, nerūdijančio plieno pipetės dėklas, amatų popierius, siūlai (arba guminė juosta), ne absorbuojanti medvilnė, mažos lazdelės, kilpa, etilo alkoholis, natrio chloridas (NaCl), 0, 1 N druskos rūgštis (HCI), 0, 1 N natrio hidroksidas (NaOH ), distiliuotas vanduo, maistinių medžiagų sultinys, maistinė agaras, skystas mėginys (pvz., tvenkinio vanduo), kietas mėginys (pvz., dirvožemis), paviršiaus mėginys (pvz., stalviršis, kūno paviršius, žaizda), pH popierius (arba pH metras), grūstuvas ir skiedinys (arba homogenizatorius), bunseno degiklis, karšto oro orkaitė, autoklavas, inkubatorius, laminarinė srauto kamera.

Procedūra:

1. Penkios pipetės (nerūdijančio plieno pipetės dėkle), šeši Petri lėkštelės ir pora ir skiedinio (arba viena homogenizatoriaus puodelio) sterilizuojamos 180 ° C temperatūroje 3 valandas karšto oro orkaitėje. Arba jie gali būti padengti rankiniu popieriumi, susietu su sriegiu arba gumine juosta ir sterilizuoti autoklave kartu su terpė (6.1 pav.).

2. 0, 85 g NaCl ištirpinama 100 ml distiliuoto vandens 250 ml stiklinėje ir 90 ml šios druskos tirpalo pilama į 100 ml kūginę kolbą. Burna yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta.

3. Pasveriami maistinių medžiagų sultinio terpės ingredientai, reikalingi 100 ml sultinio. Alternatyviai pasveriamas nustatytas kiekis paruoštų maistinių medžiagų sultinio miltelių (ingredientų mišinys).

4. Sudedamosios dalys (arba paruošti milteliai) ištirpinami 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje purtant ir sukant. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį. PH nustatomas iki 7, 0, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudojamas 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis. Kolba prireikus kaitinama, kad visiškai ištirptų ingredientai.

5. Sultinys pasiskirsto į 5 mėgintuvėlius (kiekvienas iš jų yra maždaug 10 ml), užsukami į burną, užpurškiami rankomis, padengti rankomis ir susieti su sriegiu arba gumine juosta.

6. Maistinių agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 200 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 200 ml distiliuoto vandens 500 ml kūginėje kolboje.

Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 0, naudojant 0, 1 N HC1, jei jis yra didesnis arba naudoja 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis. Kolba sušildoma, kad būtų visiškai ištirpintas agaras. Tada ji yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta.

7. Tepinėliai gaminami sukant medvilnę aplink mažų lazdelių antgalius. Nedaug tokių tamponų laikomi mėgintuvėlyje, o medvilnės antgaliai žemyn. Bandomasis vamzdelis yra užsukamas į medvilnę, padengtas amatų popieriumi ir sujungtas su sriegiu arba gumine juosta.

8. 100 ml kūginė kolba su 90 ml fiziologinio tirpalo, 5 mėgintuvėliai su maistinių medžiagų sultiniu, 500 ml kūginė kolba, kurioje yra 200 ml maistinių agaro terpės, ir mėgintuvėlis su tamponais sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis). 15 minučių autoklave.

9. Po sterilizavimo sterilizuotos medžiagos pašalinamos iš autoklavo ir tam tikrą laiką leidžiama atvėsti, neleidžiant terpei kietėti. Medžiagos aušinimas neleidžia kondensuotis ir kauptis vandens lašeliuose plokštelėse. Jei laikymo metu terpė jau buvo paruošta ir sukietėjusi, ji turi būti suskystinta atsargiai, kol visiškai ištirps.

10. Norint paruošti maistinių agaro plokšteles, prieš sterilizuotą maistinę agaro terpę atvėsina ir sukietėja, šiltoje išlydytoje aplinkoje pilamas aseptiškai į 6 sterilizuotus Petri lėkšteles (maždaug 20 ml), kad išlydyta terpė padengtų dugną. Petri lėkšteles visiškai ištuštinkite.

Tada plokštės yra padengtos dangteliais ir leidžiama atvėsti, kad jose sukietėtų terpė. Vandens garai, kurie gali kondensuotis ant plokščių ir dangčių vidinio paviršiaus, išgarinami, laikant plokšteles ir dangtelius apverstoje padėtyje inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje maždaug 1 valandą.

11. Skystas ėminys (įtariama, kad joje yra bakterijų, pvz., Tvenkinio vandens). Vienas ml kiekvieno mėginio aseptiškai pipetuojamas į 2 sultinio mėgintuvėlius (6.2 pav.). Vamzdžiai sukasi. Skystąjį mėginį taip pat pipete pipete į 2 agarines plokšteles, po 0, 1 ml, ir paskleisti ant agaro terpės paviršiaus, naudojant liepsnos sterilizuotą stiklo barstytuvą.

Prieš kiekvieną paskleidimą stiklo barstytuvu jis supilamas į alkoholį ir liepsnojamas ant bunseno degiklio. Inokuliuoti sultinio mėgintuvėliai ir plokštės inkubuojami inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Plokštelės yra inkubuojamos apverstoje padėtyje, apačioje.

12. Kietam mėginiui (pvz., Dirvožemiui) aseptiškai pasveriama 10 g mėginio ir homogenizuojama sterilizuotoje šepečiu ir skiediniu arba homogenizavimo indeliu po 100 ml sterilaus fiziologinio tirpalo įpilant 100 ml kūginėje kolboje.

Ši homogeninė bakterijų suspensija aseptiškai pipetuojama į 2 sultinio mėgintuvėlius ir 2 agaro plokšteles, kaip ir 11 pakopoje, ir inkubatoriuje inkubuojama 24 valandas 37 ° C temperatūroje (6.2 pav.). Plokštelės yra inkubuojamos apverstoje padėtyje, apačioje.

13. Paviršiaus mėginių ėmimui paviršius, kuriame įtariama, kad joje yra bakterijų (stalviršis, kūno paviršius, žaizda), yra pažymėtas vieneto ploto (pvz., 1 cm ² ), kuris patrinamas sterilizuotu tamponu. Tepalas yra paliečiamas ant abiejų kairiųjų agaro plokščių paviršiaus.

Srautai sterilizuojami liepsnos sterilizuota kilpa. Sraigtinei linijai linija traukia beveik lygiagrečias linijas. Tai sudaro pirmines juosteles. Po liepsnos sterilizavimo kilpos, antrinės juostelės yra traukiamos beveik įstrižai į pirmines juosteles. Panašiu būdu tretinės ir ketvirtinės juostelės yra padaromos aseptiškai.

14. Tuomet plokštelės inkubatoriuje inkubuojamos apverstoje padėtyje, viršuje žemyn, 37 ° C temperatūroje (6.2 pav.).

15. Viena nepadarinėta agaro plokštė ir vienas nesupakuotas sultinio mėgintuvėlis yra inkubuojami kaip kontrolė, siekiant užtikrinti tinkamą sterilizaciją, kaip rodo jų augimas. Šis žingsnis yra neprivalomas.