Oksidazės tyrimas su bakterijomis, siekiant išsiaiškinti jų gebėjimą hidrolizuoti želatiną, gaminant želatinazę

Oksidazės bandymas su bakterijomis, siekiant sužinoti jų gebėjimą hidrolizuoti želatiną, gaminant želatinazę!

Principas:

Kai kurios bakterijos turi galimybę hidrolizuoti želatiną, nes jos gali gaminti proteolitinį fermentą „želatinazė“.

Želatina patenka į gyvsidabrio chlorido, kuris sukelia permatomumą, o jo hidrolizuoti galutiniai produktai neišlaiko gyvsidabrio chlorido, dėl kurio jie nesukelia tokio permatomumo, o gamina skaidrumą.

Želatinizacijos bandyme bandomosios bakterijos auginamos ant želatinos turinčių agaro plokštelių. Kai bakterijų kolonijos yra matomos, plokštės užpilamos gyvsidabrio chlorido tirpalu. Jei bakterijos turi galimybę hidrolizuoti želatiną, jos kolonijos hidrolizuoja želatiną terpėje juos supančiose vietose, o likusios plokštelių sritys išlaiko ne hidrolizuotą želatiną.

Dėl to, užtvindžius gyvsidabrio chlorido tirpalu, aplink kolonijas susidaro skaidrios skaidrios zonos, nes aplink juos susidarę hidrolizuoti produktai su gyvsidabrio chloridu nesudaro nuosėdų. Kita vertus, likusios plokštelių dalys tampa permatomos, nes šiuose plotuose nehidrolizuota želatina susidaro su gyvsidabrio chloridu.

Reikalingos medžiagos:

Petri lėkštelės, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, inokuliavimo kilpa, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indas, inkubatorius, Fraizer želatinos agaras, gyvsidabrio chlorido tirpalas, izoliuotos kolonijos arba grynos bakterijų kultūros.

Procedūra:

1. Išvalomi du Petri lėkštelės, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta (7.20 pav.). Šis etapas ir Petri lėkštelių sterilizavimas 6 etape yra praleidžiami, jei sterilizuoti orkaitėje sterilizuoti Petri lėkštelės yra tiesiogiai naudojami

2. Fraizer želatinos agaro terpės sudedamosios dalys (kurių pagrindinė sudėtinė dalis yra želatina) arba jos paruoštas milteliai, reikalingi 100 ml terpės, pasveriami ir ištirpinami 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje purtant ir sukant .

3. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir sureguliuojamas iki 7, 2, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudojant 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis.

4. Kolba visiškai pašildoma, kad agaras būtų visiškai ištirpintas.

5. Kolba yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungiama su sriegiu arba gumine juosta.

6. Du Petri lėkštelės ir kūginė kolba su Fraizer želatinos agaro terpė sterilizuojama 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Po sterilizavimo jie pašalinami iš autoklavo ir kartais leidžiama atvėsti, neleidžiant terpei kietėti. Medžiagos aušinimas neleidžia kondensuotis ir kauptis vandens lašeliuose plokštelėse. Jei laikymo metu terpė jau buvo paruošta ir sukietėjusi, ji turi būti suskystinta atsargiai, kol visiškai ištirps.

8. Norint paruošti želatinos agaro plokštes, prieš sterilizuotą Frazier želatinos agaro terpę atvėsina ir sukietėja, šiltoje išlydytoje aplinkoje į sterilizuotas Petri lėkšteles (maždaug 20 ml) pilamas aseptiniu būdu, geriau laminarinio srauto kameroje. kad išlydyta terpė visiškai padengtų Petri lėkštelių dugną.

Tada plokštės yra padengtos dangteliais ir leidžiama atvėsti, kad jose sukietėtų terpė. Vandens garai, kurie gali kondensuotis ant plokščių ir dangčių vidinio paviršiaus, išgarinami laikant plokšteles ir dangtelius apverstą vietą inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje maždaug 1 valandą.

9. Kiekviena plokštė apatinėje pusėje yra pažymėta keturiais ketvirčiais.

10. Bandomųjų bakterijų „inokuliacija“ atliekama aseptiškai, pageidautina laminarinio srauto kameroje, kiekvieno ketvirčio centre, padarytais bakterijų tašku (arba nedideliu tepalu), naudojant liepsnos sterilizuotą kilpą. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

11. Inokuliuojamos plokštelės inkubuojamos inkubatoriuje, kol bakterijos kolonijos yra matomos, apverstos, viršutinės dalies, 37 ° C temperatūroje 24–48 valandas.

12. Plokštelės užpilamos gyvsidabrio chlorido tirpalu (HgCl2).