Dezoksiribonukleazės bandymas su bakterijomis, siekiant išsiaiškinti jų gebėjimą hidrolizuoti DNR (su paveikslu)

Dezoksiribonukleazės testas (DNazės testas) dėl bakterijų, siekiant išsiaiškinti jų gebėjimą hidrolizuoti DNR (su paveikslu)!

Principas:

Kai kurios bakterijos gali hidrolizuoti dezoksiribonukleino rūgštį (DNR) į oligonukleotidus, nes jie gali gaminti ekstraląstelinį hidrolizinį fermentą „dezoksiribonukleazę“ (DNase).

Nors DNR nusodina druskos rūgštimi, nes neskaidrumas, jo hidrolizuoti galutiniai produktai, oligonukleotidai nesusidaro druskos rūgštimi, kuriai jie nesukelia tokio skaidrumo; greičiau - skaidrumą.

DNazės teste bandomosios bakterijos auginamos ant agaro plokštelių, turinčių DNR. Kai bakterijų kolonijos yra matomos, plokštės užpilamos druskos rūgštimi. Jei bakterijos turi galimybę hidrolizuoti DNR, jos kolonijos DNR hidrolizuoja terpėje juos supančiose vietose, o likusios plokštelių sritys turi ne hidrolizuotą DNR.

Dėl to, užtvindžius druskos rūgštimi, aplink kolonijas susidaro skaidrios skaidrios zonos, nes hidrolizuoti produktai, oligonukleotidai, suformuoti aplink juos, nesudaro nuosėdų su druskos rūgštimi.

Kita vertus, likusios plokščių sritys tampa nepermatomos, nes šiuose plotuose susidariusi nehidrolizuota DNR susidaro su druskos rūgštimi. Jei vietoje druskos rūgšties yra naudojamas toluidino mėlynas, rožinė rožinė halo gaminama tik aplink kolonijas.

Reikalingos medžiagos:

Petri lėkštelės, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, inokuliavimo kilpa, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indelis, inkubatorius, DNazo agaras, IN vandenilio chlorido rūgštis (arba 0, 1% toluidino mėlyna), izoliuotos kolonijos arba grynos bakterijų kultūros.

Procedūra:

1. Išvalomi du Petri lėkštelės, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta (7.23 pav.). Šis etapas ir Petri lėkštelių sterilizavimas 6 etape yra praleidžiami, jei sterilizuoti orkaitėje sterilizuoti Petri lėkštelės yra naudojami tiesiogiai.

2. DNazės agaro terpės sudedamosios dalys (kurių sudėtyje yra DNR kaip pagrindinė sudedamoji dalis) arba jo paruoštas milteliai, reikalingi 100 ml terpės, pasveriami ir ištirpinami 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje.

3. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir sureguliuojamas iki 7, 2, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudojant 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis.

4. Kolba visiškai pašildoma, kad agaras būtų visiškai ištirpintas.

5. Kolba yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungiama su sriegiu arba gumine juosta.

6. Du Petri lėkštelės ir kūginė kolba, turinti DNazės agaro terpę, sterilizuojamos 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Po sterilizavimo jie pašalinami iš autoklavo ir tam tikrą laiką leidžiama atvėsti, neleidžiant terpei kietėti. Medžiagos aušinimas neleidžia kondensuotis ir kauptis vandens lašeliuose plokštelėse. Jei laikymo metu terpė jau buvo paruošta ir sukietėjusi, ji turi būti suskystinta atsargiai, kol visiškai ištirps.

8. Norint paruošti DNazės agaro plokšteles, prieš sterilizuotą DNazo agaro terpę atvėsinant ir kietinant, šiltoje išlydytoje aplinkoje jis įpilamas aseptiškai, pageidautina laminarinio srauto kameroje, į du sterilizuotus Petri lėkšteles (maždaug 20 ml). išlydyta terpė visiškai uždengia Petri lėkštelių dugną.

Tada plokštės yra padengtos dangteliais ir leidžiama atvėsti, kad jose sukietėtų terpė. Vandens garai, kurie gali kondensuotis ant plokščių ir dangčių vidinio paviršiaus, išgarinami, laikant plokšteles ir dangtelius apverstoje padėtyje inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje maždaug 1 valandą.

9. Kiekviena plokštė apatinėje pusėje yra pažymėta keturiais ketvirčiais.

10. Bandomųjų bakterijų „inokuliacija“ atliekama aseptiškai, pageidautina laminarinio srauto kameroje, kiekvieno ketvirčio centre, padarytais bakterijų tašku (arba nedideliu tepalu), naudojant liepsnos sterilizuotą kilpą. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

11. Inokuliuojamos plokštelės inkubuojamos inkubatoriuje, kol bakterijos kolonijos yra matomos, apverstos, viršutinės dalies, 37 ° C temperatūroje 24–48 valandas.

12. Plokštelės užpilamos 1 N druskos rūgšties tirpalu (arba 0, 1% toluidino mėlyna).