Bakterijos, esančios mėginyje serijinio praskiedimo agaro padengimo metodu arba viso plokštelių skaičiavimo metodu (TPC)

Bendras plokštelių skaičius (TPC):

Suskaičiuoti mėginyje esančių bakterijų serijos praskiedimo agaro padengimo metodu arba bendrą plokštelių skaičiavimo metodą (TPC).

Tikslas:

Bakterijų aktyvumo lygis konkrečiame mėginyje tam tikromis sąlygomis daugiausia priklauso nuo bendro jame esančių bakterijų skaičiaus, nepriklausomai nuo jų rūšies.

Todėl labai dažnai reikia nustatyti bendrą bakterijų, esančių maisto, vandens, dirvožemio, oro ir audinių mėginiuose, skaičių mikrobiologinės analizės metu. Šis bendras bakterijų skaičius apima ir gyvas, ir negyvas bakterijas. Negyvosios bakterijos negali augti ir daugintis.

Tik gyvos bakterijos (gyvybingos bakterijos) gali augti ir daugintis, o tai lemia specifinį bakterijų aktyvumą. Todėl labai dažnai reikia išvardyti gyvybingas bakterijų ląsteles įvairiuose mėginiuose. Tačiau dauguma skaičiavimo metodų, tokių kaip tiesioginis mikroskopinis skaičius, elektroninių ląstelių skaičius, cheminiai metodai ir spektrofotometrinis metodas, skaičiuoja tiek gyvas, tiek negyvas ląsteles.

Šie metodai negali diskriminuoti gyvų ir negyvų ląstelių. Todėl serijinio praskiedimo-agaro dengimo metodas, kuriame išvardytos tik gyvybingos bakterijų ląstelės, yra visuotinai naudojamas gyvų gyvybingų ląstelių skaičiavimas įvairiuose mėginiuose.

Principas:

Tam tikra kieto mėginio masė aseptiškai homogenizuojama devyniose sterilaus fiziologinio tirpalo tūriuose, kad gautų homogeninę bakterijų suspensiją. Skystas mėginys yra tiesiogiai naudojamas kaip homogeninė bakterijų suspensija. Tokiu būdu gautos bakterijų suspensijos yra praskiestos nuosekliai (10 kartų, 100 kartų, 1000 kartų ir tt). Čia 10-1, 10 -2, 10 -3 ir tt vadinami skiedimais.

Jų reciprokai (10 1, 10 2, 10 3 ir tt) vadinami skiedimo veiksniais. Tam tikras bakterijų suspensijos kiekis kiekviename praskiedime yra inokuliuojamas ant agaro plokštelių ir tinkamai paskleidžiamas taip, kad atskirtos atskiros bakterijos ląstelės būtų plačiai atskirtos ir izoliuojamos viena nuo kitos.

Bakterijų užkrėtimas jo skaičiavimu atliekamas dviem būdais:

1. Supilkite plokštelės techniką

2. Skleistinės plokštės technika

1. Supilkite plokštelės techniką:

Šiuo metodu į sterilizuotą Petri lėkštelę supilama 1 ml bakterijų suspensijos, o po to užpilama suskystinta maistinių medžiagų agaro terpė. Petri lėkštelė švelniai sukama, kad suspensija galėtų būti maišoma su terpe vienodai. Leidžiama atvėsti ir sukietėti.

2. Skleistinės plokštelės technika:

Šioje technikoje 0, 1 ml bakterijų suspensijos supilama ant paruoštos agaro plokštės. Tada suspensijos lašas vienodai pasiskirsto ant agaro plokštelės sterilizuotu stiklo barstytuvu.

Siekiant sumažinti klaidą, kiekviena praskiesta suspensija padengiama ant 2-5 pakartotinių plokščių. Inokuliuojamos plokštelės inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Per šį laikotarpį kiekviena atskirta bakterijų ląstelė ant agaro plokštės sparčiai auga ir dauginasi, kad būtų sukurta makroskopinė matoma bakterijų ląstelių masė, vadinama „kolonija“. Taigi, kolonijų skaičius ant plokštės rodo bakterijų skaičių mėginyje.

Tačiau labai dažnai, sklaidos metu, kai kurios ląstelės gali nesugerti tinkamai, ir nedaug tokių neatsiejamų ląstelių gali sukelti vieną koloniją. Be to, nedaug ląstelių turi tendenciją pasilikti porose, grandinėse ar grupėse.

Čia kiekviena pora, grandinė ar klasteris sukuria koloniją. Taigi, kiekviena kolonija, griežtai suprantama, neatspindi vienos bakterijos. Štai kodėl, užuot išreiškę bakterijų skaičių „Ne. bakterijų / gm arba ml mėginio “, jis labai dažnai išreiškiamas kaip kolonijas sudarančių vienetų skaičius per gm arba ml (CFU / gm arba ml).

Bendras plokštelių skaičius (TPC) pirminiame mėginyje apskaičiuojamas CPU skaičių padauginus iš atitinkamų praskiedimo faktorių. Laikomasi „skaičiavimo taisyklių“, skaičiuojant bakterijų skaičių pradiniame mėginyje.

Reikalingos medžiagos:

Petri lėkštelės (15 nos.), 2 ml pipetės (10 k.), 10 ml pipetė (1 Nr.), Mėgintuvėliai (10 sek.), Kūginės kolbos (500 ml ir 1 litras po 1), 500 ml stiklinė (2 nos.), Stiklo purkštuvas, nerūdijančio plieno pipetės dėklas, amatų popierius, sriegis (arba guminė juosta), ne absorbuojanti medvilnė, etilo alkoholis, natrio chloridas (NaCl), 0, 1 N druskos rūgštis (HCI), 0, 1 N natrio hidroksidas (NaOH), distiliuotas vanduo, maistinė agaras, skystas mėginys (pvz., Tvenkinio vanduo / nuotekų vanduo), kietas mėginys (pvz., Dirvožemis / žuvies mėsa / austrių mėsa / perdirbtas maistas), pH popierius (arba pH metras), grūstuvas ir skiedinio (arba homogenizatoriaus), bunseno degiklio, karšto oro orkaitės, autoklavo, inkubatoriaus, laminarinio srauto kameros, Kvebeko kolonijų skaitiklių.

Procedūra:

1. Dešimt pipetės (nerūdijančio plieno pipetės dėkle), 15 Petri lėkštelių ir pora ir skiedinio (arba vienos homogenizatoriaus puodelio) sterilizuojamos karšto oro orkaitėje 180 ° C temperatūroje 3 valandas. Arba jie gali būti padengti amatų popieriumi, susietu su sriegiu arba gumine juosta ir sterilizuoti autoklave kartu su terpė (6.6 pav.).

Petri lėkštelių skaičius ir atitinkamai naudojamas terpės kiekis apskaičiuojamas priklausomai nuo reikalingų pakartojimų ir skiedimų skaičiaus. Čia stikliniai indai ir terpė buvo paimti vienai replikacijai ir skiedimui iki 10 -6 . Stiklo paketų skaičius ir sterilizavimo metu sunaudotos terpės kiekis yra šiek tiek daugiau, kad būtų išvengta atsitiktinių klaidų, nes sterilizavimas yra ilgas procesas.

2. 4.25 g NaCl ištirpinamas 500 ml distiliuoto vandens, kad gautumėte fiziologinį tirpalą (0, 85%). 225 ml šios druskos tirpalo pilama į 500 ml kūginę kolbą. Jos burna yra užsukama į medvilnę, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta. Jis naudojamas kaip pirmieji skiedikliai kietam mėginiui praskiesti.

3. Į kiekvieną mėgintuvėlį į pipetę taip pat įpilama 9, 0 ml kairiosios druskos. Jų burnos yra prigludusios prie medvilnės, padengtos amatų popieriumi ir sujungtos su sriegiu arba gumine juosta. Jie naudojami kaip skiedikliai, skirti serijiniam praskiedimui.

4. Maistinių agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 500 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 500 ml distiliuoto vandens 1 litrų kūginėje kolboje.

Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 0, naudojant 0, 1 N HC1, jei jis yra didesnis arba naudoja 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis. Kolba sušildoma, kad būtų visiškai ištirpintas agaras. Tada ji yra prigludusi prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta.

5. 500 ml kūginė kolba, kurioje yra 225 ml fiziologinio tirpalo, 10 mėgintuvėlių, kurių kiekvienoje yra 9 ml fiziologinio tirpalo, ir 1 litro kūginė kolba, kurioje yra 500 ml maistinės agaro terpės, sterilizuojama 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių. autoklave.

6. Po sterilizavimo sterilizuotos medžiagos pašalinamos iš autoklavo ir tam tikrą laiką leidžiama atvėsti, neleidžiant terpei kietėti. Medžiagos aušinimas neleidžia kondensuotis ir kauptis vandens lašeliuose plokštelėse. Jei laikymo metu terpė jau buvo paruošta ir sukietėjusi, ji turi būti suskystinta atsargiai, kol visiškai ištirps.

7. Norint paruošti agaro plokšteles, prieš sterilizuotą maistinę agaro terpę atvėsinant ir kietinant, šiltoje išlydytoje aplinkoje jis įpilamas aseptiniu būdu į 6 sterilizuotus Petri lėkšteles (maždaug po 20 ml), kad išlydyta terpė padengtų petro dugną. patiekalų.

Tada plokštės yra padengtos dangteliais ir leidžiama atvėsti, kad jose sukietėtų terpė. Vandens garai, kurie gali kondensuotis ant plokščių ir dangčių vidinio paviršiaus, išgarinami, laikant plokšteles ir dangtelius apverstoje padėtyje inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje maždaug 1 valandą.

8. 25 g kieto mėginio (pvz., Žuvies mėsos / austrių mėsos / perdirbto maisto) svoris ir homogenizuotas 225 ml sterilizuoto fiziologinio tirpalo (skiediklio) aseptiškai (6.7 pav.). Taip gaunamas 10 kartų praskiedimas (praskiedimas = 10 -1 ). Skystam mėginiui 1 ml mėginio pipete supilama į 9 ml sterilizuoto fiziologinio tirpalo mėgintuvėlį. Tai taip pat suteikia 10 kartų praskiedimą (praskiedimas = 10 -1 ).

9. 1 ml 10-1 skiedimo perkeliamas į 9 ml sterilizuoto fiziologinio tirpalo kitame mėgintuvėlyje. Taip gaunamas 100 kartų praskiedimas (praskiedimas = 10 -2 ). Iš 10-2 skiedimo 1 ml supilama į sterilizuotą Petri lėkštelę ir 0, 1 ml į agaro plokštę iš tos pačios pipetės. Kiekvienam praskiedimui naudojama atskira sterilizuota pipete. Po naudojimo jis supilamas į šalinimo indą.

10. 1 ml 10-2 skiedimo perkeliama į 9 ml sterilizuoto fiziologinio tirpalo kitame mėgintuvėlyje. Taip gaunamas 1000 kartų praskiedimas (praskiedimas = 10 -3 ). Iš 10-3 skiedimo 1 ml supilama į sterilizuotą Petri lėkštelę ir 0, 1 ml į agaro plokštę iš tos pačios pipetės. Panašiai praskiedimas tęsiamas iki 10 -6 serijos, kiekvieną kartą perkeliant 1 ml į sterilizuotą Petri lėkštelę ir 0, 1 ml į agaro plokštę iš tos pačios pipetės.

11. Tada suspensijos lašai ant agaro plokštelių aseptiškai paskleidžiami sterilizuotu stiklo barstytuvu. Paskleidus į kiekvieną plokštelę, jis yra sterilizuojamas liepsnojant, įpilant į alkoholį ir parodant liepsną. Tai yra „paskirstymo plokštelės technika“.

12. Paimamos Petri lėkštelės, kuriose yra 1 ml bakterijų suspensijos, ir sterilizuotas suskystintas maistinių medžiagų agaras. Jie švelniai sukasi, kad suspensija galėtų būti maišoma su terpe vienodai. Plokštelėms leidžiama atvėsti, kol terpė sukietėja. Tai yra „supilimo plokštelės technika“.

13. Tada plokštelės inkubatoriuje inkubuojamos 37 ° C temperatūroje inkubatoriuje apverstoje padėtyje, apačioje žemyn (6.7 pav.).

14. Inokuliuojama agaro plokštė yra inkubuojama kaip kontrolė, užtikrinanti tinkamą sterilizaciją, kaip rodo jo augimas.

Pastabos:

Bakterijų kolonijų skaičius ant plokštelių skaičiuojamas tiesiogiai arba naudojant Kvebeko kolonijų skaitiklį. Iš to apskaičiuojama bakterijų, esančių viename grame arba ml pradinio mėginio, skaičius. Tai vadinama skaičiavimu.

Apskaitos taisyklės:

1. Reikia apsvarstyti Petri lėkšteles su 30–300 kolonijų.

2. Vidutinis dublikatų ir trijų egzempliorių skaičius (R 1, R 2 R 3 …) laikomas tik tuo atveju, jei vienas skaičius yra ne didesnis kaip du kartus. Jei vienas yra daugiau nei dvigubai didesnis už kitą mažesnę vertę.

3. Įpilant plokštelės techniką, bakterijų skaičius yra Nr. X 10 c / gm, kur c = praskiedimo koeficientas. Sklaidos plokštelės technikai bakterijų skaičius yra Nr. X10 c + 1 / gm, kur c = praskiedimo koeficientas. Skaičius paverčiamas dviem skaitmenimis po kablelio (x.yz X 10 m ). Pavyzdžiui, 288 X104 išreiškiama kaip 2, 88 X 10 6 .

4. Jei visuose skiedimuose kolonijų skaičius yra didesnis nei 300, skaičiuojamas didžiausio praskiedimo atveju ir jei visuose praskiedimuose jis yra mažesnis nei 30, atsižvelgiama į mažiausio praskiedimo skaičių. Abiem atvejais skaičiuojamas skaičius: Apskaičiuotas Nr. X 10 c / gm arba ml skiedimo plokštelės technikai ir apskaičiuotas Nr. X 10 c + 1 / gm arba ml skiedimo plokštės technikai.

5. Jei nesilaikoma kolonijų, bet kokio praskiedimo atveju, tai yra: Apskaičiuotas <1 x mažiausias skiedimas.

6. Kadangi serijinis praskiedimas vyksta 10 kartų, matematiniu požiūriu akivaizdu, kad jokie du skiedimai negali turėti kolonijų tarp 30 ir 300. Pavyzdžiui, jei 10 -3 turi 50 kolonijų, 10 -2 turėtų būti 500 (ty> 300) ir 10-4 turėtų turėti 5 (ty <30) kolonijas.

Tačiau tai neįvyksta iš tikrųjų, nes bakterijos nėra vienalytė; veikiau kaip suspensija skiedikliuose. Jei yra du skiediniai, turintys skaičiuotinas kolonijas (nuo 30 iki 300), kiekvienu praskiedimu pirmiausia apskaičiuokite kolonijas sudarančių vienetų skaičių gm arba ml.

Jei viena vertė yra daugiau nei dvigubai didesnė, nurodykite mažesnę vertę. Jei ne, paimkite dviejų vertybių vidurkį ir nurodykite šią vertę.