7 Elektroninių mikroskopų objektų stebėjimo metodai
Kai kurie iš svarbiausių metodų, kurie yra naudojami objektų stebėjimui elektronų mikroskopuose, yra: (1) šešėlis (2) neigiamas dažymas (3) ultra plonas profiliavimas (4) užšaldymas-ofortavimas (5) ląstelių sudedamųjų dalių lokalizavimas (6) Fermentų lokalizavimas (7) Autoradiografija.
(1) Shadow-casting:
Šviesos liejimo metu mikroskopinis objektas išdžiovinamas specialiame tinklelyje, patalpintame vakuuminiame inde.
Labai plonas metalo sluoksnis (pvz., Platina) ant objekto nusodinamas iš labai įkaitinto gijos, įstrižai, taip, kad objektas nepadengtoje pusėje sukurtų šešėlį.
Išnagrinėjus šešėlinį vaizdą, pateikiama informacija apie objekto formą (objekto paviršiaus topografinius požymius), kuriuos galima stebėti skenuojančiu elektroniniu mikroskopu.
(2) Neigiamas dažymas:
Šis metodas laikomas labai mažų objektų, tokių kaip virusai ir bakterijos flagella, minutės detalėms stebėti. Elektronui nepermatoma medžiaga, kaip antai fosfotungstinė rūgštis arba jos druska, leidžia susidaryti storio nuosėdų sluoksnį ant objekto paviršiaus, neįeinant į jį. Kai elektronų mikroskopo elektronai negali eiti per šiuos dengtus paviršius, šios struktūros tampa aiškiai matomos.
(3) Ypač plonas profiliavimas:
Nepažeista mikrobinė ląstelė yra per stora, kad būtų galima vizualizuoti jos vidines smulkias struktūras elektronų mikroskopu. Ląstelėje esančių smulkių struktūrų stebėjimui ląstelė yra įdėta į plastikinės medžiagos bloką ir supjaustoma ultra-plonomis sekcijomis (taip plona kaip 60 nm).
Tiksli struktūra suprantama stebint keletą labai plonų skiltelių, suskirstytų skirtingais lygiais ir skirtingais kampais. Konstrukcijų kontrastas gali būti pagerintas naudojant specialias dėmes, tokias kaip uranas ir lantano druskos.
(4) Įšaldymas:
Norint gauti itin plonas objekto dalis, jis turi būti tvirtinamas cheminiu būdu. Dėl tokių cheminių procedūrų atsiranda artefaktų. Šie artefaktai yra įveikti įšaldymo-ėsdinimo būdu. Įšaldymo ėsdinimo metu mėginys yra užšaldytas bloko viduje ir yra išskaidytas, o jo viduje yra užšaldytas.
(5) Ląstelių sudedamųjų dalių lokalizavimas:
Tai specialus metodas, atliekamas siekiant nustatyti chemines ląstelių sudedamąsias dalis. Pavyzdžiui, norint surasti antigeną ląstelėje, ultra plona ląstelės dalis yra apdorojama su feritino žymimu antikūnu, kuris prisijungia prie antigeno, kad susidarytų su feritinu pažymėtas antikūnas-antigenas.
Kadangi feritinas yra geležies turinčio didelio tankio medžiaga, antikūnų ir antigenų kompleksas žymiai veikia elektronų pluošto praėjimą, tokiu būdu sukuriant didelį kontrastą aiškiam stebėjimui elektronų mikroskopu.
(6) Fermentų lokalizavimas:
Šis metodas naudojamas norint nustatyti fermentų padėtį ląstelėse. Pavyzdžiui, nustatant fermentą izocitratą dehidrogenazę, paruošiamos ultra-plonos bakterijų ląstelių dalys. Tada koloidinis auksas yra tvirtinamas prie fermento, imunocheminiu būdu. Koloidinį aukso fiksuotą fermentą galima stebėti elektronų mikroskopu.
(7) Autoradiografija:
Tai citocheminė technika, kurioje tam tikros cheminės sudedamosios dalies vieta objekte nustatoma stebint vietą, kurioje radioaktyviosios medžiagos tampa. Objektas pirmiausia patenka į radioaktyviąją medžiagą, kad būtų galima jį įsisavinti.
Tada jis padengtas fotografijos emulsijos sluoksniu ir kelias valandas laikomas tamsoje. Medžiagos skilimo metu spinduliuojama jonizuojanti spinduliuotė emulsijoje sukuria latentinius vaizdus. Po fotografijos apdorojimo išsivystę vaizdai matomi elektroninio mikroskopo pavidalu kaip sidabro grūdai preparate.
