Ortho-nitrofenilo galaktozido bandymas su bakterijomis, siekiant rasti jų gebėjimą hidrolizuoti orto-nitrofenil-PD-galaktozidą

Perskaitykite šį straipsnį, kad sužinotumėte apie Ortho-nitrofenilo Galaktozido bandymo su bakterijomis efektyvumą, kad rastumėte jų gebėjimą hidrolizuoti orto-nitrofenil-PD-Galaktozidą!

Principas:

Kai kurios bakterijos gali fermentuoti laktozę. Jie vadinami „laktozės fermentuojančiomis bakterijomis“ arba „laktozės fibridais“.

Kiti, kurie negali fermentuoti laktozės, yra vadinamos laktozės neturinčiomis fermentacinėmis bakterijomis arba „laktozės neturinčiomis medžiagomis“.

Laktozės fermentacijos bakterijos gali gaminti du fermentus, ty „permeazę“ ir „β-galaktozidazę“, kurie yra susiję su laktozės fermentavimu. Leisti padėti laktozei patekti į bakterijų ląsteles, o β-galaktozidazė hidrolizuoja laktozę į gliukozę ir galaktozę, β-galaktozidazė yra intracelulinis indukuojantis fermentas, kurio gamybą sukelia laktozės buvimas bakterijų ląstelių aplinkoje.

Nors laktozės fermentacijos bakterijos gali gaminti tiek permeazę, tiek ir β-galaktozidazę, laktozės nefermentuojančios bakterijos negali gaminti permeazės, bet gali gaminti β-galaktozidazę. Atliekamas ONPG tyrimas, siekiant nustatyti, ar laktozės nesergančios bakterijos gamina β-galaktozidazę.

Dėl to laktozės nefermentuojančių bakterijų ląstelių membrana yra ištirpinama pridedant tolueno, kad būtų išlaisvinti visi intraceluliniai fermentai, įskaitant P-galaktozidazę, jei yra. Fermentas β-galaktozidazė hidrolizuoja orto-nitrofenil-β-D-galcozidą (ONPG) orto-nitrofenoliu, kuris yra geltonos spalvos.

Orto-nitrofenilo galaktozido bandyme (ONPG testas) bandomosios bakterijos auginamos trimis cukraus geležies agaro (TSI agaro) šlaituose, kurių sudėtyje yra laktozės. Jei bakterijos yra nefermentuotos laktozės, kaip parodyta raudonu užpakaliu ir raudonu šlaitu, druskos tirpale yra stora bakterijų suspensija, į kurią pridėta tolueno, po to - ONPG tirpalas. Jei bakterijos gali gaminti fermentą P-galaktozidazę, bakterijų suspensijos spalva pasikeičia į geltoną.

Reikalingos medžiagos:

Mėgintuvėliai, kūginė kolba, medvilnės kamščiai, inokuliavimo kilpa, inokuliavimo adata, autoklavas, bunseno degiklis, laminarinė srauto kamera, šalinimo indelis, inkubatorius, TSI agaras, toluenas, o-nitrofenil-β-D-galaktozido (ONPG) tirpalas, izoliuotos kolonijos arba grynos bakterijų kultūros.

Procedūra:

1. TSI agaro terpės sudedamosios dalys (kurių pagrindiniai komponentai yra 3 cukrūs ir geležis) arba 100 ml terpės, reikalingos paruoštiems milteliams, sveriami ir ištirpinami 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje. purtant ir sukant (7.16 pav.).

2. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 4, naudojant 0, 1 N HCI, jei jis yra didesnis arba naudoja 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis.

3. Kolba sušildoma, kad agaras būtų visiškai ištirpintas terpėje.

4. Prieš kietinant, šiltoje lydytoje aplinkoje terpė paskirstoma į 5 mėgintuvėlius (po 20 ml).

5. Mėgintuvėliai yra prijungti prie medvilnės, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta.

6. Jie sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Po sterilizavimo jie pašalinami iš autoklavo ir laikomi įstrižai, kad atvėsintų ir sukietintų terpę, kad gautų TSI agaro nuolydį.

8. Bandomosios bakterijos yra inokuliuojamos aseptiškai, pageidautina sluoksniuotoje srauto kameroje, į griovelius, susiurbiant į užpakalį ir nukreipiant juos į slankų paviršių, naudojant liepsnos sterilizuotą adatą. Po kiekvienos inokuliacijos adata sterilizuojama.

9. Inokuliuoti inkubatoriai inkubuojami 24 valandas 37 ° C temperatūroje.

10. Jei bakterija yra laktozės fermentatorius, ji nėra parenkama ONPG bandymui. Jei bakterijos yra nefermentuojančios laktozės, kaip parodyta raudonu užpakaliu ir raudonu šlaitu, ji parenkama ONPG testui.

11. Į mėgintuvėlį, kuriame yra 0, 25 ml fiziologinio tirpalo, stora bakterijų kultūra įdedama naudojant sterilizuotą liepsną, kad bakterijos taptų storos.

12. Pridedamas vienas lašelis tolueno, sumaišomas ir inkubuojamas 5 minutes 37 ° C temperatūroje.

13. Pridedama O-nitrofenilgalaktozido tirpalo (ONPG tirpalas) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 30 minučių. Tada pastebimas spalvos pokytis. Vėliau spalvos pokytis stebimas po 24 valandų.