Eksperimentas, skirtas išskirti viruso kolifagą (su diagrama)

Eksperimentuokite, kad išskirtumėte viruso kolifagą!

Principas:

Bakteriofagas arba fagas (virusas), užkrėsti bakterijas, yra Escherichia coli, vadinamas kolifagu (coli: E. coli-, fagas: bakteriofagas).

Jis gali būti gaunamas iš įvairių natūralių šaltinių, pvz., Dirvožemio, išmatų ir žaliavinių nuotekų. Jo izoliacija nuo šių šaltinių nėra labai paprasta, nes ji yra mažai koncentruota.

Todėl, pirma, jo skaičius padidinamas sodrinimo pakopoje, kurioje į kolipagą turinčio mėginio pridedama turtinga šeimininkų bakterijų (ty E. coli) kultūra ir inkubuojama. Coliphage užkrėsta E. coli ir daugėja gausiai. Ši kolipagės turtinga kultūra centrifuguojama, kad nusodintų daleles.

Nuosėdos išmestos ir supernatantas filtruojamas per mikrobų filtrą, kad būtų išsaugotos bakterijos ir kitos dalelės, o kolifagas gali praeiti. Filtratas, kuriame gausu kolifagų, naudojamas E. coli suspensijai, kuri po to leidžiama augti kaip susiliejanti veja ant agaro plokštės.

Kolipagė auga E. coli ląstelėse ir jas lizuoja. Bakterijų ląstelių lizė lemia aiškių zonų susidarymą besiformuojančioje bakterijų vejoje. Šios aiškios zonos vadinamos plokštelėmis. Daroma prielaida, kad kiekviena aiški zona yra sudaryta iš vienos kolipados.

Reikalingos medžiagos:

Pipetės, kūginės kolbos, petri lėkštelės, mėgintuvėliai, medvilnės kamščiai, bunseno degiklis, šalinimo indas, centrifugas, membraninio filtravimo aparatas, laminarinė srauto kamera, autoklavas, inkubatorius, bakteriofaginis sultinys, triptonas minkštas agaras, triptono kietasis agaras, maistinių medžiagų sultinio kultūra. bakterijos Escherichia coli (pvz., E. coli B), mėginys (pvz., žalios nuotekos).

Procedūra:

1. Penkios pipetės (nerūdijančio plieno pipetės dėkle) ir penki Petri lėkštelės sterilizuojamos karšto oro orkaitėje 180 ° C temperatūroje 3 valandas. Arba jie gali būti padengti amatų popieriumi, susietu su sriegiu arba gumine juosta ir sterilizuoti autoklave kartu su terpė (8.5 pav.).

2. Bakteriofago sultinio terpės arba jos paruošto miltelių sudedamosios dalys, reikalingos 100 ml terpės, pasveriamos, ištirpinamos 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje ir pH sureguliuojamas iki 7, 6. Kolba yra prijungta prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta.

3. Sveriami 100 ml terpės tirpalo triptono minkšto agaro terpės arba paruošto miltelių ingredientai, ištirpinti 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje ir pH sureguliuojamas iki 7, 5.

4. Ši skysta terpė paskirstoma į 5 mėgintuvėlius (po 2 ml), užsukti į medvilnę, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta.

5. Tryptono kietosios agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuoto vandens 250 ml kūginėje kolboje, šildant po pH koregavimo iki 7, 5. Kolba yra prijungta prie medvilnės, padengta amatų popieriumi ir sujungta su sriegiu arba gumine juosta.

6. Kolba, kurioje yra bakteriofaginio sultinio, 5 triptono minkštųjų agaro mėgintuvėlių, kolba, kurioje yra sunkiosios agarinės agarinės terpės, ir tuščia medvilnė su 250 ml kūgine kolba, sterilizuojama 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Kūginėje kolboje sterili triptono kietoji agaro terpė aseptiškai supilama į 5 sterilizuotus Petri lėkšteles ir leidžiama atvėsti, kad gautų 5 tirpto kietos agaro plokštelės.

8. Į sterilizuotą tuščią 250 ml kūginę kolbą įpilama 5 ml sterilizuoto bakteriofago sultinio, 5 ml E. coli B sultinio kultūros ir 45 ml neapdorotų nuotekų aseptiniu būdu, pageidautina laminarinio srauto kameroje (8.6 pav.) .

9. Kolba inkubuojama 37 ° C temperatūroje 24 valandas, kad kolofagas nuotekose galėtų daugintis šeimininkų bakterijų ląstelėse (E. coli B ląstelės).

10. Kolbos turinys supilamas į 100 ml centrifugavimo mėgintuvėlius ir centrifuguojama centrifugoje esant 2500 aps./min. Centrifugoje, kad nusėdėtų dalelės. Nuosėdos sunaikinamos.

11. Supernatantas, turintis daug kolifagų, filtruojamas per membraninį filtravimo aparatą. Likutis pašalinamas.

12. Imami penki sterilizuoti triptono minkštieji agaro vamzdžiai ir kaitinami vandens vonioje iki 100 ° C, kad būtų ištirpintas agaras. Vamzdžiai atvėsinami ir palaikomi 45 ° C temperatūroje vandens vonioje.

13. Naudojant sterilų pipetę, 1, 2, 3, 4 ir 5 lašai bakterijų neturinčio filtrato, turtingo kolifagu, aseptiškai perkeliami į penkis triptono minkštus agaro mėgintuvėlius.

14. Kiekvienam triptono minkštojo agaro mėgintuvėliui aseptiškai perkeliama 0, 1 ml Escherichia coli B maistinės medžiagos sultinio kultūros.

15. Penkių triptono minkštųjų agaro mėgintuvėlių, turinčių virusą, kolifagą ir bakterijas, turinys E. coli B greitai maišomas sukant vamzdžius tarp delnų.

16. Turinys supilamas į penkias triptono kietas agaro plokšteles (paženklintas nuo 1 iki 5 lašų), taip sudarant dvigubo sluoksnio plokštelės kultūros preparatą. Plokštelės švelniai sukasi ir sukietėja.

17. Inokuliuojamos plokštelės inkubatoriuje inkubuojamos apverstoje padėtyje 37 ° C temperatūroje 24 valandas.

Pastabos:

1. Visos plokštelės stebimos plokštelių formavimo vienetų (PFU), kurie išsiskiria kaip aiškios zonos ant bakterijų vejos. Plokštelių susidarymas rodo, kad kultūroje yra kolifagų.

2. Kiekviena plokštelė rodo turtingą izoliuotos kolipagos augimą.

3. Plokštelių skaičius skaičiuojamas visose plokštelėse ir pateikiamas lentelėje (8.1 lentelė).

8.1 lentelė. Kolifazo skaičiaus stebėjimas :