Tikslas išskirti skirtingas bakterijas, esančias tam tikrame mėginyje, ir išlaikyti jų grynąsias kultūras

Siekiama išskirti skirtingas bakterijas, esančias tam tikrame mėginyje, ir išlaikyti jų grynąsias kultūras.

Tikslas:

Gamtoje aptinkamos bakterijos nevyksta kaip segreguotos rūšys, o jos atsiranda kaip mišrios įvairių rūšių populiacijos.

Todėl, norint ištirti atskiras bakterijų rūšis, pirmiausia reikia jas atskirti nuo mišrios populiacijos. Šis procesas vadinamas „bakterijų izoliacija“.

Tai pasiekiama auginant mišrią bakterijų populiaciją ant kietos terpės paviršiaus į atskiras kolonijas. „Kolonijos“ - tai individualios, makroskopiškai matomos bakterijų masės, auginamos kietos terpės paviršiuje, kiekviena iš jų yra vienos bakterijos dauginimas.

Kadangi kiekviena kolonija atsiranda dėl vienos bakterijos augimo ir kartotinio dauginimo, visos kolonijoje esančios bakterijos priklauso tai pačiai rūšiai. Taigi kiekviena kolonija yra labai didelė vienos bakterijos rūšies populiacija.

Šios kolonijos aseptiškai perkeliamos į atskiras maistinių agaro šlaitus ir leidžiama ten augti. Atskiros bakterijų rūšys, auginamos atskirai ant agaro, vadinamos „grynosiomis kultūromis“. Kas 15–30 dienų jie perkeliami į šviežią griovelius, kad jie neprarastų savo pradinių savybių dėl pernelyg perpildymo, maistinių medžiagų trūkumo ir metabolitų kaupimosi.

Tokiu būdu laboratorijoje nuolat palaikomos grynos bakterijų kultūros, reguliariai perkeliant į šviežiąsias griovelius. Šis procesas vadinamas „grynos kultūros palaikymu“. Grynos kultūros laikomos laboratorijoje tolesniam identifikavimui įvairiais dažymo, biocheminiais, serologiniais ir molekuliniais metodais, taip pat jų naudojimui ateityje.

„Atsarginės kultūros“ - tai standartinės grynosios kultūros, kurių identifikavimas buvo nustatytas tarptautiniu mastu genties, rūšies, pogrupio, tipo ar sub-tipo lygiu. Jie saugomi tarptautiniu mastu pripažintose mikrobiologijos laboratorijose.

Kitos laboratorijos gali jas gauti iš šių laboratorijų ir savo laboratorijose laikyti savo atsargų kultūromis, pakartotinai perkeldamos į šviežiąsias šlaitus reguliariai. Jie naudojami patvirtintoms grynų kultūrų, gautų šiose laboratorijose, identifikavimui, palyginant jų charakteristikas su standartinių atsargų kultūromis.

Principas:

Mišri bakterijų populiacija, esanti tam tikroje medžiagoje (kieta, skysta ar paviršinė), auginama maistinių agaro lėkštelėse, naudojant pluošto plokštelės metodą, kaip aprašyta anksčiau „Bakterijų auginimas“. Kiekviena izoliuota kolonija, nustatyta ant agaro plokštelės, susideda iš vienos bakterijos rūšies, nes kiekviena kolonija auga iš vienos bakterijos.

Taigi, bakterijos išskiriamos ant agaro plokštelių dviem būdais:

a) Skleistinės plokštelės metodas

(b) Plokštelės metodas

Reprezentatyvios kolonijos (kolonijos, turinčios skirtingų savybių) yra atrenkamos ir aseptiškai inokuliuojamos, kad atskirtų agaro šlaitus, kad gautų grynąsias kultūras. Po kiekvienos 15-30 dienų jie yra perkeliami į šviežią šlaitus šiems gryniems augalams palaikyti.

Reikalingos medžiagos:

Mėgintuvėliai (5 nos.), 250 ml kūginė kolba (1), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCI, distiliuotas vanduo, maistinė agaras, ne absorbuojanti medvilnė, kilpa, amatų popierius, siūlai (arba guminė juosta), pH popierius (arba pH matuoklis), bunseno degiklis, autoklavas, laminarinė srauto kamera, inkubatorius, plokštės, kuriose yra izoliuotų bakterijų kolonijų (sklaidos plokštelė arba štampavimo plokštė).

Procedūra:

1. Maistinių agaro terpės arba jos paruošto miltelių, reikalingų 100 ml terpės, sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos 100 ml distiliuotame vandenyje 250 ml kūginėje kolboje purtant ir sukant (6.4 pav.).

2. Jo pH nustatomas naudojant pH popierių arba pH matuoklį ir nustatomas iki 7, 0, naudojant 0, 1 N HC1, jei jis yra didesnis arba naudojant 0, 1 N NaOH, jei jis yra mažesnis.

3. Kolba sušildoma, kad agaras būtų visiškai ištirpintas terpėje.

4. Prieš kietinant, šiltoje lydytoje aplinkoje terpė paskirstoma į 5 mėgintuvėlius (po 20 ml).

5. Mėgintuvėliai yra prijungti prie medvilnės, padengti amatų popieriumi ir sujungti su sriegiu arba gumine juosta.

6. Jie sterilizuojami 121 ° C temperatūroje (15 psi slėgis) 15 minučių autoklave.

7. Po sterilizavimo jie pašalinami iš autoklavo ir laikomi įstrižai, kad būtų galima atvėsti ir kietinti terpę. Šie mėgintuvėliai, kurių sudėtyje yra sukietėjusios maistinės agarinės terpės, yra vadinami „maistinėmis agaro slankomis“.

8. 10 ir 11 žingsniai turėtų būti atliekami pagal aseptinę techniką, pageidautina laminarinio srauto kameroje. Prieš išimant medvilnės kištuką ir prieš jį padedant, konteinerių, kuriuose yra sterilizuotų terpių ar kultūrų, burna turi būti rodoma ant bunseno degiklio liepsnos.

Prieš pradedant naudoti kilpas turi būti sterilizuojamas per liepsną, kaitinant iki karšto, o po to - 30 sekundžių, kad atvėsintumėte iki kambario temperatūros. Jie niekada neturėtų būti naudojami, kai labai karšta, kai jie palieka mikrobus, kai juos paliečia.

9. Ankstesniame eksperimente, jei išsklaidytos kolonijos galėjo būti pastebėtos ant skardos plokštelės ar plokštelės, penkios kolonijos, turinčios skirtingų savybių, atrenkamos kaip reprezentatyvios kolonijos.

10. Cilindras sterilizuojamas per liepsną ir bakterijų kilpa iš kiekvienos reprezentatyvios kolonijos yra imamasi aseptiškai. Kilpa įterpiama į agaro nuolydį, kad bakterijų kilpa patektų į šlaito galą. Kilpa yra braukiama į išorę banguotu būdu, liečiant šlaito paviršių, todėl susidaro banguota linija.

11. Cilindras yra sterilizuotas liepsnos ir panašiai, likusios keturios reprezentatyvios kolonijos yra inokuliuojamos į kairę per keturis šlaitus. Po kiekvienos inokuliacijos kilpa sterilizuojama.

12. Penkios inokuliuojamos plokštelės inkubatoriuje inkubuojamos 24 valandas 37 ° C temperatūroje.

Pastabos (kultūrinės charakteristikos):

(i) banguota linija su augimo ilgiu, stebima:

Augimas vyko.

Skersinė charakteristika vertinama taip (6.5 pav.).

1. Augimo gausa:

Augimo kiekis nurodomas kaip ne, nedidelis, vidutinis ar didelis.

2. Pigmentacija:

Chromogeniniai mikroorganizmai gali gaminti intracelulinius pigmentus, kurie yra atsakingi už organizmo spalvą, kaip matyti paviršiaus kolonijose. Kiti organizmai gamina ekstraląstelinius tirpius pigmentus, kurie išsiskiria į terpę ir taip pat gamina spalvą. Tačiau dauguma organizmų yra ne chromomeriniai ir pasirodys balti arba pilki.

3. Optinės charakteristikos:

Optinės charakteristikos gali būti vertinamos pagal šviesos, perduodamos per augimą, kiekį.

Šios charakteristikos apibūdinamos kaip:

(a) Nepermatomas: nėra šviesos perdavimo.

(b) Permatomas: dalinis šviesos perdavimas.

4. Forma:

Vienos eilės augimo juostos išvaizda ant agaro paviršiaus žymima taip:

(a) „Filiform“: nuolatinis, srieginis augimas su lygiais kraštais.

(b) Echinuliavimas: Nuolatinis, srieginis augimas su netaisyklingais kraštais.

(d) Efektyvumas: plonas, plinta augimas.

(e) Arborescent: Medis panašus augimas.

(f) Rhizoid: šaknis panašus augimas.

ii) augimas be inokuliacijos linijos:

Netinkamas inokuliacijos metodas, Inokuliavimas kartojamas C Bakterijų skaičiavimas.

C. Bakterijų skaičiavimas:

Bakterijų aktyvumo lygis konkrečiame mėginyje tam tikromis sąlygomis daugiausia priklauso nuo bendro jame esančių bakterijų skaičiaus, nepriklausomai nuo jų rūšies. Todėl labai dažnai reikia nustatyti bendrą bakterijų, esančių maisto, vandens, dirvožemio, oro ir audinių mėginiuose, skaičių mikrobiologinės analizės metu.

Bakterijų skaičiaus nustatymas konkrečiame mėginyje vadinamas bakterijų skaičiavimu. Yra įvairių bakterijų skaičiavimo būdų, kaip nurodyta toliau. Visi šie metodai reikalauja, kad homogeninėje suspensijoje būtų bakterijų.

Todėl laikoma, kad skystieji mėginiai yra homogeninės bakterijų suspensijos ir yra tiesiogiai naudojami, o kieti mėginiai homogenizuojami steriliais fiziologiniais tirpalais, kad gautų homogenines bakterijų suspensijas.

Dažnai nenaudojama:

(I) Tiesioginiai metodai:

a) Tiesioginis mikroskopinis skaičius

(b) Elektroninis ląstelių skaitiklis

(II) Netiesioginiai metodai:

c) Cheminiai metodai

(d) Turbidimetrinis metodas

(e) Membraninio filtro skaičius

Labiausiai naudojamas:

f) Serijinio praskiedimo-agaro padengimo metodas arba bendras plokštelių skaičiavimo metodas (TPC metodas)

a) Tiesioginis mikroskopinis skaičius:

Šiuo metodu homogeninės bakterijų suspensijos alikvotinėje dalyje esančių bakterijų skaičius skaičiuojamas tiesiogiai po mikroskopu, o bendras bakterijų skaičius mėginyje nustatomas matematiškai.

Šio metodo privalumas yra tas, kad jis yra labai greitas. Trūkumai yra tai, kad skaičiuojamos ir gyvos (gyvybingos), ir negyvos ląstelės, o metodas nėra jautrus mažiau nei milijono bakterijų populiacijoms mililitre.

Skaičiavimus galima atlikti dviem būdais:

i) Petroff-Hauser kolegija:

Tai specializuota skaičiavimo kamera, kurioje homogeninės bakterijų suspensijos alikvotinė dalis skaičiuojama tiesiogiai po mikroskopu.

ii) Veislės dėmės:

Bakterijų ląstelės yra tiesiogiai skaičiuojamos mikroskopu naudojant dažytus tepinukus, esančius 1 mm ² plote, esančiame ant skaidrių. Jis dažniausiai naudojamas pieno bakterijų skaičiavimui.

(b) Elektroninis ląstelių skaitiklis:

Elektroninis ląstelių skaitiklis, pvz., „Coulter counter“, naudojamas tiesiogiai skaičiuoti bakterijų ląstelių skaičių. Homogeninei bakterijų ląstelių suspensijai, paruoštai laidiame skystyje, leidžiama praeiti per minutę angą, per kurią teka elektros srovė.

Atsparumas angoje registruojamas elektroniniu būdu. Kai ląstelė eina per angą, kuri yra ne laidininkė, ji trumpam padidina atsparumą. Atsparumo didėjimo momentų skaičius yra įrašomas elektroniniu būdu, o tai rodo, kiek bakterijų yra suspensijoje.

Šio metodo privalumas yra tas, kad jis yra labai greitas. Trūkumai yra tai, kad skaičiuojamos ir gyvos (gyvybingos), ir negyvos ląstelės, ir prietaisas negali atskirti bakterijų ląstelių ir inertinių dalelių.

c) Cheminiai metodai:

Šiais metodais apskaičiuojamas šių medžiagų, daugiausia cheminių medžiagų, kiekis, kuris didėja didėjant bakterijų populiacijai.

Pagrindiniai apskaičiuoti parametrai yra šie:

i) Baltymų koncentracija

(ii) DNR koncentracija

iii) Sausas svoris

iv) anglies dioksido gamyba

(v) Įsiurbimas deguonimi

vi) Pieno rūgšties gamyba

d) Turbidimetrinis metodas:

Kai bakterijos auginamos skystose maistinių medžiagų terpėje (pvz., Maistinių medžiagų sultinyje), jų gausus augimas verčia žiniasklaidą drumsti, nes bakterijų ląstelės jose dažniausiai lieka suspenduotos. Drumstumas didėja padidinus ląstelių skaičių terpėje. Didėjant drumstumui, padidėja terpės „absorbcija“ arba „optinis tankis (OD)“.

Bakterijų ląstelių suspensijos terpėje OD matuojamas spektrofotometru esant 600 nm. Bakterijų ląstelių skaičius suspensijoje nustatomas lyginant OD su standartine kreivė, paruošta pagal skirtingų žinomų bakterijų koncentracijų OD reikšmes. Metodas yra greitas, bet apsiriboja bakterijų suspensijomis, kuriose yra daugiau nei 10 milijonų ląstelių.

e) membraninio filtro skaičius:

Šis metodas naudojamas, kai bakterijų skaičius skystame mėginyje yra mažesnis. Siekiant padidinti bakterijų koncentraciją, pirmiausia skystas mėginys filtruojamas aseptiškai per sterilizuotą membraninio filtro aparatą, naudojant sterilų membraninį filtrą.

Membraninis filtras, kuriame yra įstrigusių bakterijų, aseptiškai perkeliama į sterilų Petri lėkštelę, kurioje yra sugeriamosios padangos, prisotintos selektyvia diferencine skysta terpe. Vidutinė terpė patenka į filtro paviršių. Po inkubacijos kolonijų, susidariusių ant filtro, skaičius skaičiuojamas naudojant paprastą mikroskopą.