Genomo sekos priežastys ir metodika

Genomų sekvenavimas yra sudėtingas, sudėtingas ir reikalauja specializuotų technologijų. Galima suskirstyti 500–800 bp segmentą. Tačiau genomai yra labai dideli, pvz., E. coli su 4, 2 x 106 bp ir 3, 2 x 109 bp žmonių.

Taigi mažiems segmentams reikia sekos. Tokie segmentai gaminami atsitiktinai suskirstant genominę DNR į mažas dalis. Tokie fragmentai paprastai sutampa su kitais fragmentais jų galuose. Fragmentai klonuojami vektoriuje, siekiant generuoti organizmo genominę biblioteką.

Viso genomo sekos priežastys:

(i) Jame pateikiama informacija apie genų atradimą ir pateikiamas genų sąrašas.

(ii) Jis atspindi galimus ryšius tarp genų.

(iii) Genomų sekvenavimas yra įrankių rinkinys tolesniam eksperimentavimui.

(iv) Genetinė informacija apie organizmą pateikiama iš genų sekos.

v) Visiškas genetinis organizmo sekos nustatymas suteikia visą genetinę informaciją, reikalingą organizmui suformuoti.

Genomo sekos nustatymo metodikos:

(i) Bakterinių dirbtinių chromosomų (BAC) kontrolinių mėginių sekos:

Bakterinės dirbtinės chromosomos yra tiesiog plazmidės, skirtos labai ilgų DNR segmentų (ty 100 000–300 000 bp) klonavimui. Šie vektoriai naudojami genominėms bibliotekoms, kuriose įterpimo dydis yra 80-100 kb. Tūkstančių bazinių porų DNR fragmentai yra klonuojami į BAC vektorių.

Genominė biblioteka yra tikrinama, nustatant bendrus apribojimo klonus, vadinamus contigs. Kontrolės nariai turi tam tikrus persidengiančius regionus, kad būtų galima tiksliai nustatyti jų buvimo vietą.

Galutinis fizinių kartografavimo metodų tikslas yra gauti pilną kontigenciją kiekvienai genomo chromosomai. Užfiksuoti suskirstymai suskirstomi pertraukiant didelius DNR fragmentus į mažus segmentus. Kiekvienas kontigento klonas sekvenuojamas. Nukleotidų seka vienoje klonavimo pagrindu nustatoma tol, kol suskirsto visas genomas.

ii) Atsitiktinis šautuvų sekos nustatymas arba „iš apačios į viršų“ metodas:

Viename organizme galima klonuoti bet kokį norimą geną iš kito organizmo. Šiam visam pirmojo organizmo genomui virškinama restrikcijos endonukleaze, kad būtų gautas atsitiktinis fragmentų mišinys.

Genominės DNR atsitiktinės (shotgim) bibliotekos yra sukonstruotos mažuose, ty 2, 0 kb ir vidutiniuose, ty 10 kb įterpti plazmidiniuose vektoriuose, kartu su genomo šautuvu dideliu įdėklu BAC biblioteka (80-100 kb). Fragmentai įterpiami į plazmidės vektorių ir rekombinantinės plazmidės transformuojamos į norimą šeimininko ląstelę.

Šaudymo pistoletų sekvenavimu atsitiktinai atrinkti klonai sekvenuojami tol, kol bus išanalizuoti genominės bibliotekos klonai. Kitaip tariant, mes galime pasakyti, kad atsitiktinių šūvių pistoletų chromosomos yra suskirstytos į sekcijas, o genominės DNR sekcija yra suskirstyta į milijonus mažų segmentų, o visi segmentai suskirstomi nešališkai.

Suderintos DNR sritys, kurios suformavo didesnius ir didesnius genomo DNR segmentus. DNR sekvenavimas atliekamas abiejuose atsitiktinai atrinktų klonų įterpimo galuose tiek iš mažų, tiek vidutinių plazmidės bibliotekų, kad būtų užtikrintas bent tris kartus didesnis genomo aprėptis.

Mažos DNR fragmentai atsitiktinai įterpiami į skirtingas plazmidės molekules. Perdengiančių įdėklų atveju jie visi yra kilę iš tos pačios genominės vietos, bet iš skirtingų regionų persikėlė į kairę arba į dešinę.

Sutampa fragmentai yra nukreipti į coting arba į atitinkamo regiono seką (šautuvo metodas). Prokariotiniai genomai turi mažai atitinkamų DNR ir šaudymo pistoletų sekos suteikia gerų rezultatų. Eukariotai turi daugybę pakartotinių sekų.

Visa tai sukelia painiavą. Tačiau fragmentų sutapimas surinkimo fazėje naudojamas skaičiuojant. Kompiuterio programa identifikuoja persidengiančias sekas ir sujungia jas į vieną ištisinę ruožą. Šis procesas sėkmingai pritaikytas visų „Celera Genomics“ paskelbtų mikrobų genomų sekų sekvenavimui.