Genomika: genomikos struktūriniai ir funkciniai tyrimai

Genomika: genomikos struktūrinės ir funkcinės studijos!

Žodis genomas buvo įvestas H. Winkler (1920), nurodydamas visą chromosomų ir papildomų chromosomų genų, esančių organizme, įskaitant virusą, rinkinį.

Terminas genomika, kurią sukūrė TH Roderick (1987), reiškia kartografavimą ir sekos nustatymą genomų struktūros ir organizavimo analizei. Tačiau šiuo metu genomika apima genomų sekvenavimą, viso organizmo užkoduoto baltymų rinkinio nustatymą ir genų bei metabolinių takų funkcionavimą organizme.

Genomikos tyrimas suskirstytas į šias dvi sritis:

1. Struktūrinė genomika apima visą genomų seką arba visą organizmo gaminamų baltymų rinkinį. Įvairūs veiksmai yra šie: i) didelės skiriamosios gebos genetinių ir fizinių žemėlapių statyba, (ii) genomo sekvenavimas ir iii) viso baltymų rinkinio nustatymas organizme. Ji taip pat apima atitinkamų baltymų trijų dimensijų struktūrų nustatymą.

2. Funkcinė genomika tiria genų ir metabolinių takų veikimą, ty genų ekspresijos modelius organizmuose.

Genomų sekvenavimas:

Genomų sekvenavimas yra labai sudėtingas ir techniškai sudėtingas procesas. Vienu metu galima suskirstyti 500-600 bp fragmentą. Priešingai, genomai yra labai dideli, pvz., 4, 2 x 106 E. coli ir 3, 2 x 109 bp žmonių. Todėl genokso seka turi būti gauta labai mažame mažų gabalų skaičiumi, tada šie gabalai surenkami į genomo seką.

Suskirstymui naudojami vienetai generuojami, genominę DNR suskaidant į fragmentus atsitiktiniuose taškuose. Kaip rezultatas, fragmento vieta genome turi būti eksperimentiškai nustatyta. Visi fragmentai, gauti iš organizmo genominės DNR, yra klonuojami tinkamame vektoriuje, kuris generuoja organizmo genominę biblioteką. Du genomų sekos nustatymo metodai yra: (a) klonų sekos nustatymas ir (b) šautuvų sekos nustatymas.

a) Klonavimo pagal kloną seka:

Šiuo metodu fragmentai pirmiausia lyginami į kontigentus, kurie taip pat vadinami BAC kontigentų nukreipimu. Kontrolė susideda iš klonų serijos, kuriose yra persidengiančių DNR vienetų, konvertuojančių konkretų chromosomos regioną arba net visą chromosomą. Paprastai jie gaminami naudojant BAC (bakterinės dirbtinės chromosomos) ir kosmidų klonus.

Bendras požiūris kuriant kontigentus yra identifikuoti klonus, turinčius gretimų DNR segmentų iš chromosomos, pvz., Chromosomų pėsčiomis, chromosomų šokinėjimą ir tt Taigi kontigento nariai turi turėti tą patį persidengiantį regioną, kad būtų galima tiksliai nustatyti jų vietą - kontingento metu. Galutinis fizinių žemėlapių sudarymo procedūrų tikslas yra gauti pilną kontigenciją kiekvienai genomo chromosomai.

Kontekto klonuoti DNR fragmentai gali būti koreliuojami su vietomis išilgai chromosomos, gautos susiejant arba citogenetiniu žemėlapiu. Tai galima pasiekti nustatant kontigento narius, kuriuose yra intarpų, turinčių tokių genų, kurie jau buvo susieti su ryšiais arba citologiniais metodais. Tai leistų suderinti kitus kontigento narius išilgai chromosomos. Alternatyviai, RFLP (restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas) ir kiti DNR žymenys gali būti naudojami susiejant žemėlapio vietas su kontigento nariais.

b) Shot-Gun Sequencing:

Šiuo požiūriu atsitiktinai atrinkti klonai sekvenuojami tol, kol bus analizuojami visi genomo bibliotekoje esantys klonai. Surinkimo programinė įranga organizuoja tokiu būdu gautą nukleotidų sekos informaciją į genomo seką. Ši strategija labai gerai veikia su prokariotiniais genomais, kurie turi mažai pasikartojančių DNR. Tačiau eukariotiniai genomai turi daugybę pakartotinių sekų, kurios sukelia painiavą sekos lygiavime. Šios problemos išsprendžiamos naudojant didžiules skaičiavimo galias, specializuotą programinę įrangą ir vengiant tokių regionų, kuriuose yra daug pasikartojančių DNR (pvz., Centromeriniai ir telomeriniai regionai).

Genomo sekos sudarymas:

Genomo sekų nustatymo projektams reikėjo sukurti didelio našumo technologijas, kurios generuotų duomenis labai sparčiai. Dėl to reikėjo naudoti kompiuterius šiam informacijos srautui valdyti ir pagimdė naują discipliną, vadinamą bioinformatika. Bioinformatika yra susijusi su informacijos apie biologines sistemas saugojimu, analize, interpretavimu ir naudojimu (veikla, pvz., Genomo sekų sudarymas, genų identifikavimas, funkcijų priskyrimas identifikuotiems genams, duomenų bazių sudarymas ir kt.).

Siekiant užtikrinti, kad genomo nukleotidų seka būtų išsami ir be klaidų, genomas sekvenuojamas daugiau nei vieną kartą. Kai organizmo genomas sekvenuojamas, surenkamas ir koreguojamas (koreguojant klaidas), prasideda kitas genomikos etapas, ty anotacija.

Genų prognozavimas ir skaičiavimas:

Gavus genomo seką ir patikrinus tikslumą, kitas uždavinys yra surasti visus baltymus koduojančius genus. Tai pirmas žingsnis anotacijoje. Anotacija yra procesas, kuris identifikuoja genus, jų reguliavimo sekas ir jų funkcijas. Jis taip pat identifikuoja ne baltymų koduojančius genus, įskaitant tuos, kurie koduoja r-RNR, t-RNR ir mažas branduolines RNR. Be to, identifikuojamos ir apibūdinamos mobilios genetinės dalys ir pasikartojančios sekos šeimos.

Baltymų kodavimo genų nustatymas atliekamas sekos seka, naudojant kompiuterinę programinę įrangą arba akį. Baltymų koduojančius genus identifikuoja atviro skaitymo rėmai (ORF). ORF turi seriją kodonų, kurie nurodo aminorūgščių seką, jis prasideda inicijavimo kodonu (paprastai ATG) ir baigiasi užbaigimo kodonu (TAA) TAG arba TGA). ORF paprastai nustatomi kompiuteriu ir yra veiksmingas bakterijų genomų metodas.

Eukariotinių genomų genai (įskaitant žmogaus genomą) turi keletą savybių, dėl kurių tiesioginė paieška yra mažiau naudinga. Pirma, dauguma eukariotinių genų turi egzonų modelį (koduojančius regionus) pakaitomis su intronais (nekoduojančiais regionais). Todėl šie genai nėra organizuojami kaip nuolatiniai ORF. Antra, genai žmonėms ir kitiems eukariotams dažnai yra plačiai išdėstyti, taip didinant tikimybę surasti netikrus genus. Tačiau naujesnės ORF skenavimo programinės įrangos versijos, skirtos eukariotiniams genomams, skenavimas tampa efektyvesnis.

Išnagrinėjus genomo seką ir prognozuojant genus, kiekvienas genas yra tiriamas vienu metu, siekiant nustatyti koduoto genų produkto funkciją ir suskirstyti į funkcines grupes. Ši analizė apima kelias programas. Pavyzdžiui, galima ieškoti tokių duomenų bazių kaip „Gene Bank“, kad surastumėte panašius genus, išskirtus iš kitų organizmų. Prognozuojami ORF gali būti lyginami su žinomais, gerai apibūdintais bakterijų genais. Galiausiai galima ieškoti tokių nukleotidų sekų funkcijų motyvams, kurie koduoja baltymų domenus, susijusius su specifinėmis funkcijomis.

Taigi genomo analizės tikslas yra nustatyti visų genų funkcijas ir suprasti, kaip šie genai sąveikauja organizmo vystyme ir veikloje.

Funkcinė genomika:

Jis gali būti apibrėžiamas kaip visų genų produktų, koduotų organizmo genomas, funkcijos nustatymas. Jame yra šie parametrai: (1) kai ir kur išreiškiami tam tikri genai (ekspresijos profiliavimas), (ii) specifinių genų funkcijos, selektyviai mutuojant norimus genus, ir (iii) sąveikos, kurios vyksta tarp baltymų ir tarp baltymų ir kitos molekulės. Funkcinė genomika bando ištirti visus genome esančius genus vienu metu. Todėl funkcinės genomikos metodai leidžia atlikti didelio našumo analizę, leidžiančią labai greitai kaupti duomenis.

i) Išraiškos profiliavimas:

Ląstelių tipų / audinių, kuriuose genas yra išreikštas, ir geno ekspresijos nustatymas vadinamas ekspresijos profiliavimu. Funkcinės genomikos tikslas yra ištirti visų genų ekspresijos modelį tuo pačiu metu; tai vadinama visuotinės raiškos profiliavimu. Tai galima padaryti RNR lygiu arba baltymų lygiu. RNR lygiu galima naudoti tiesioginės sekos mėginių ėmimo ar DNR matricas.

Baltymų lygmenyje galima naudoti arba dviejų matmenų elektroforezę, po kurios seka masių spektrometrija arba baltymų masyvai. Pasaulinės raiškos profiliavimas suteikia įžvalgų apie sudėtingus biologinius reiškinius, įskaitant diferenciaciją, atsaką į stresą, ligos pradžią ir tt Tai taip pat suteikia naują būdą nustatyti ląstelių fenotipus.

ii) genų funkcijos nustatymas:

Svarbus funkcinio genomikos aspektas yra nustatyti specifinių genų / anoniminių sekų funkciją. Galimas būdas tai pasiekti yra geno klonavimas, jo mutacija in vitro ir mutuoto geno perkėlimas į šeimininko organizmą ir jo poveikio analizė. Genomas pagal mutantines bibliotekas buvo sukurtas keliuose modeliniuose organizmuose, pavyzdžiui, bakterijose, mielėse, augaluose ir žinduoliuose. Tai kartais vadinama mutacine genomika. Tokia biblioteka gali būti sukurta vienu iš šių trijų būdų:

(a) Sisteminis kiekvieno geno mutavimas vienu metu, kuris sukels specifinių mutantinių kamienų banką.

(b) Atsitiktinio požiūrio metu genai yra mutuojami be diskriminacijos, po to apibūdinamos ir kataloguojamos atskiros mutacijos.

iii) Baltymų sąveika:

Genų funkcija atspindi jų koduotų baltymų elgesį. Šis elgesys gali būti vertinamas kaip įvairių baltymų ir baltymų bei kitų molekulių sąveikos serija. Baltymų sąveika tiriama naudojant didelio našumo technologijas. Keletas bibliotekoje esančių baltymų sąveikos žemėlapių sudarymo metodų leidžia vienu metu tikrinti šimtus ar tūkstančius baltymų. Šios sąveikos gali būti tiriamos in vitro arba in vivo. Įvairių šaltinių sąveikos su proteinais duomenys yra prilyginti duomenų bazėms.