DNR replikacija: DNR replikacijos, remonto ir rekombinacijos pastabos
Pastabos dėl DNR replikacijos, remonto ir rekombinacijos!
DNR replikacija:
Pusiau konservatyvi DNR replikacija:
DNR replikacija yra autokatalitinė DNR funkcija. Paprastai jis vyksta ląstelių ciklo S fazėje, kai chromosomos yra labai išplėstos. Kaip siūlo Watson ir Crick, DNR replikacija yra pusiau konservatyvi.
Pusiau konservatyviose replikacijose abi kryptys būtų atskirtos viena nuo kitos, išlaikytų jų vientisumą ir kiekvienas iš jų nukleotidų baseine sintezuos papildomą grandinę. Rezultatas būtų toks, kad naujai susintetinta molekulė iš vienos molekulės padengtų arba išsaugotų vieną iš dviejų krypčių, o kita kryptis būtų naujai surinkta. Yra pakankamai įrodymų, kad dvigubos DNR tikrai atkartoja pusiau konservatyviu metodu.
Meselsonas ir Stahlio eksperimentas (1958):
Šie darbuotojai augino Escherichia coli terpėje, kurioje yra 15 N izotopų. Po to, kai šios kartos atkūrė tam tikrą kartą toje terpėje, abi šios DNR juostos turėjo 15 N kaip purinų ir pirimidinų sudedamąsias dalis. Kai šios bakterijos su 15 N buvo perkeltos į auginimo terpę, turinčią 14 N, nustatyta, kad DNR, atskirtos nuo šviežios bakterijų kartos, turi vieną kryptį, sunkesnę už kitą.
Sunkesnė kryptis žymi tėvų grandinę ir lengvesnį - naują, sintetintą iš auginimo terpės, taip nurodant pusiau konservatyvų DNR replikacijos metodą ir išskiriant tiek konservatyvius, tiek dispersiškus DNR sintezės ir replikacijos modelius.
Konservatyvi replikacija nesukurtų jokių DNR molekulių su „hibridine“ konstitucija. Jei replikacija būtų išsklaidyta, DNR būtų perkelta nuo „sunkios link“ šviesos per kiekvieną kartą.
Vėlesniuose tyrimuose buvo patvirtinta, kad Meselson ir Stahl padarė išvadą, kad DNR replikacija yra pusiau konservatyvi ir išplėsta į daugelį kitų organizmų, įskaitant aukštesnius augalus ir gyvūnus.
Kairno autoradiografijos eksperimentas:
Jis naudojo radioaktyvų timiną arba tritijuotą timidiną. Auginant E. coli auginimo terpėje, kurioje yra tritijuotas timidinas, radioaktyvumas buvo įtrauktas į dukterines DNR molekules.
Autoradiografijoje dvigubos DNR molekulės rodo atkartojančią šakę, tašką, kai dvi grandinės tampa keturiomis. Po pirmojo replikacijos radioaktyvumas yra įtrauktas tik į vieną iš DNR krypčių, ir nustatyta, kad po antrosios replikacijos abu sruogos yra pažymėtos. Tai palaiko pusiau konservatyvius DNR replikacijos būdus.
JH Taylor eksperimentai su Viciafaba šaknų antgaliais taip pat patvirtina pusiau konservatyvų DNR replikacijos metodą.
i. Nuolatinis DNR replikavimas:
Okazaki teigė, kad DNR sintezė vyksta tuo pačiu metu abiejose DNR sruogose, naudojant tą patį fermento DNR polimerazę mažų izoliuotų fragmentų pavidalu. Šie segmentai yra žinomi kaip Okazaki vienetai ir susideda iš 1000-2000 nukleotidų. Jas sujungia fermento polinukleotido ligazė, baigdama polinukleotidų grandinės susidarymą.
Nepertraukiamą DNR sintezę palaiko auto-radiografinis eksperimentas.
ii. Vienpusis ir dvikryptis DNR replikavimas:
J. Cairnsas iš savo eksperimentų padarė išvadą, kad DNR sintezė prasideda fiksuotame chromosomų taške ir vyksta viena kryptimi, tačiau naujausi eksperimentai rodo dvikryptį replikavimą.
Levinthal ir Cairns pasiūlė, kad replikacijos metu dvi atkarpos visiškai neatskirtų prieš replikaciją. Vietoj to jie pradeda unzipping viename gale ir tuo pačiu metu išpakuoti segmentai pradeda pritraukti savo nukleotidų poras. Tokiu būdu originalių DNR sruogų atplėšimas ir šviežių DNR sruogų sintezė eina šalia.
DNR polimerazė:
DNR polimerazė yra pagrindinis DNR replikacijos fermentas. Jo veiklą pirmą kartą parodė Kornbergas 1956 m. Jis katalizuoja kovalentinį dezoksiribonukleotidų priskyrimą prie esamo nukleotido 3'-OH, vadinamo pradmeniu.
Dabar DNR polimerazės-1 fermentas yra laikomas DNR remonto fermentu, o ne replikacijos fermentu. Yra žinoma, kad šis fermentas turi penkias aktyvias vietas, būtent šabloną, pradmenų vietą, 5 '-> 3' skilimą arba eksonukleazės vietą, nukleozidų trifosfato vietą ir 3 '-> 5' skilimo vietą (arba 3 '-> 5 ′ egzonukleazės vietą) ).
DNR polimerazė I:
Jis daugiausia susijęs su RNA pradmenų pašalinimu iš Okazaki arba pirmtakų fragmentų ir užpildant susidariusias spragas dėl savo 5 '-> 3' polimerizavimo pajėgumo. DNR polimerazės I fermentas taip pat gali pašalinti timino dimerius, susidariusius dėl UV spinduliuotės, ir užpildyti spragą dėl išskyrimo. Tai vadinama šio fermento tikrinimo ar redagavimo funkcija.
DNR polimerazė-II:
Šis fermentas savo veikloje primena DNR polimerazę-I, bet yra DNR atstatymo fermentas ir duoda augimą 5 '-> 3' kryptimi, naudojant laisvas 3'-OH grupes.
DNR polimerazė-III:
Jis vaidina svarbų vaidmenį DNR replikacijoje. Tai multimerinis fermentas arba holoenzimas, turintis dešimt subvienetų, tokių kaip α, β, ε, θ, г, y, δ, δ ', x ir Ψ. Visi šie dešimt subvienetų yra reikalingi DNR replikacijai in vitro; tačiau visi turi skirtingas funkcijas. Pavyzdžiui, α subvienetas turi 3 '-> 5 ′ egzonukleazės korektūros arba redagavimo veiklą. Pagrindinį fermentą sudaro trys subvienetai - α, β ir θ. Likę septyni padaliniai padidina procesą (procesiškumas reiškia greitumą ir efektyvumą, su kuriuo DNR polimerazė plečia auginimo grandinę).
Eukariotinė DNR polimerazė:
Nustatyta, kad Eukai yotes (pvz., Mielės, žiurkės kepenys, žmogaus naviko ląstelės) turi penkis DNR polimerazių tipus:
i) DNR polimerazė α:
Šis santykinai didelis molekulinio svorio fermentas taip pat vadinamas citoplazminės polimerazės arba didelės polimerazės. Jis randamas tiek branduolyje, tiek citoplazmoje.
(ii) DNR polimerazė β:
Šis fermentas taip pat vadinamas branduoline polimeraze arba maža polimeraze ir randamas tik stuburiniuose gyvūnuose.
(iii) DNR polimerazė y:
Šis fermentas vadinamas mitochondrijų polimeraze ir yra koduojamas branduolyje.
(iv) DNR polimerazė δ:
Šis fermentas randamas žinduolių ląstelėse ir yra PCNA priklausomas nuo DNR sintezės proceso (PCNA = proliferuojantis ląstelių branduolinis antigenas).
(v) DNR polimerazė ε:
Anksčiau jis buvo žinomas kaip DNR polimerazė 5II. Šis fermentas yra nepriklausomas PCNA ir pasireiškia žinduolių HeLa ląstelėse ir jauniklių mielėse.
Didžioji DNR polimerazė a yra vyraujantis DNR polimerazės fermentas yra eukariotinės ląstelės ir ilgą laiką buvo laikomas vieninteliu DNR replikacijos dalyviu. Tačiau dabar dar viena polimerazė, ty DNR polimerazė 8, taip pat dalyvauja eukariotinėje DNR replikacijoje.
DNR pradmenys:
Šie fermentai katalizuoja RNR pradmenų sintezę, kuri yra būtina DNR replikacijos pradžios daugelyje organizmų sąlyga. Prieš pradedant faktinę DNR replikaciją, DNR primasės fermentas, naudojant ribonukleozido trifosfatus, turi būti sintetinami trumpi RNR oligonukleotidiniai segmentai, vadinami RNR pradmenimis arba tiesiog pradmenimis.
Šis RNR pradmuo sintezuojamas kopijuojant tam tikrą bazinę seką iš vienos DNR grandinės ir skiriasi nuo tipinės RNR molekulės, kad po sintezės gruntas lieka vandeniliu prijungtas prie DNR šablono.
Eukariotuose yra apie 10 nukleotidų ilgio pradmenų ir jie yra atliekami intervalais atsiliekančioje grandinėje, kur jie yra pailginti DNR polimerazės fermentu, kad pradėtų kiekvieną okazakio fragmentą. Šie RNR pradmenys vėliau išskiriami ir pripildomi DNR, naudojant DNR remonto sistemą eukariotuose.
Bakterijose yra žinoma, kad du skirtingi fermentai sintezuoja pradmenų RNR oligonukleotidus - RNR polimerazę (ant pagrindinės krypties) ir DNR primasą (atsiliekančioje grandinėje).
Polinukleotidinė liga:
Šis fermentas yra svarbus fermentas tiek DNR replikacijos, tiek DNR atkūrimo metu. DNR ligazė katalizuoja fosfodiesterio jungties susidarymą tarp vieno nukleotido 5'-fosforilo grupės ir artimiausio kaimyno 3-OH grupės DNR grandinėje esančio nicko pusėje; tokiu būdu jis užsandarina DNR grandinėje esančius plyšius.
Endonukleazės:
Endonukleazės, ypač restrikcijos endonukleazės, taip pat yra svarbios DNR replikacijos metu, taip pat ir DNR taisymo metu. DNR replikacijos metu galutinis lizdas gali sukelti kilmę, kad būtų galima inicijuoti replikaciją, arba ji gali sukelti nesėkmes, kad sukurtų pasukamąjį elementą, kuris palengvintų DNR išsisukimą.
Fermentai, susiję su DNR spirito atidarymu:
DNR helikazės:
DNR helikazės yra nuo ATP priklausantys nesukeliantys fermentai, kurie skatina dviejų tėvų krypčių atskyrimą ir sukuria replikacijos šakutes, kurios palaipsniui pasitraukia iš kilmės. Šablono DNR spiralės atsipalaidavimą replikacijos šakėje iš esmės galėtų katalizuoti dvi DNR helikazės, veikiančios kartu, viena, kuri vyksta išilgai pagrindinės krypties, o kita - atsilieka.
Helix destabilizuojanti kryptis (dar vadinama vieno krypties DNR surišančiais proteinais arba SSBP):
Už replikacijos šakės atskiros DNR juostos yra užkertamos kelioms aplinkybėms sukilti (arba formuoti dvigubos juostos kilpas kiekvienoje atskiroje grandinėje) pagal SSB baltymų poveikį. SSB baltymai prisijungia prie eksponuojamų DNR sruogų, nepadengdami bazių, todėl jie lieka prieinami šabloniniam procesui.
Topoizomerazės (DNR girazės):
Helikazės veikimas įveda teigiamą superpilį į dvipusę DNR prieš replikacijos šakutę. Fermentai, vadinami topoizomerazėmis, atpalaiduoja superkūšį, prijungdami prie trumpalaikio superlaidžio dvipusio, nikuodami vieną iš sruogų ir pasukdami per nepertraukiamą dalį. Tada nikas uždaromas.
Vienas topoizomerazės tipas (ty topoizomerazė I) sukelia vienos eilės pertrauką arba niką, kuris leidžia dviem DNR spiralės dalims abiejose nickų pusėse laisvai suktis viena nuo kitos, naudojant fosfodiesterio jungtį grandinėje, esančioje priešais nicką. pasukamas taškas. Antrasis topoizomerazės tipas (ty II topoizomerazė) tuo pačiu metu formuoja kovalentinį ryšį su abiem DNR spiralės kryptimis, todėl spiralėje pereina dvigubos grandinės pertrauka.
Replikonas:
Replikonas yra DNR vienetas, kuriame vyksta atskiri replikacijos veiksmai, tai yra, ji gali DNR replikuoti nepriklausomai nuo kitų DNR segmentų. Todėl kiekvienas replikonas turi kilmę, kurioje inicijuojama replikacija, ir gali turėti galą, kuriai pasibaigus replikacija sustoja.
Bakterijų ir virusų chromosomos paprastai turi vieną replikoną / chromosomą. Nors T fazė turi dvi kilmės, vienas pirminis ir vienas antrinis, tačiau pirminės kilmės atveju, antrinė kilmė paprastai yra neveikianti. E. coli kilmės vieta identifikuojama kaip genetinis lokusas oriC.
Išsami prokariotinė kilmė palaiko šias tris funkcijas: (1) replikacijos inicijavimą, (2) pradinių įvykių dažnumo kontrolę ir (3) replikuotų chromosomų atskyrimą į dukterines ląsteles.
Kilmė nustatyta bakterijose, mielėse, chloroplastuose ir mitochondrijose; jų reikšmingas bendras bruožas yra tai, kad jie yra A: T turtingi, kurie gali būti svarbūs palengvinant atkartojimą. Bakterijų kilme yra daug skirtingų trumpų (<10 bp) vietų, reikalingų jo funkcijai; šios vietos kartais yra atskirtos konkrečiais atstumais, bet ne konkrečiomis sekomis. Šios specifinės vietovės yra reikalingos skirtingiems DNR replikacijoje dalyvaujančių baltymų surišimui.
Keletas prokariotinių replikonų turi specifinių vietų, vadinamų galiniu, kuris sustabdo replikacijos šakės judėjimą ir tokiu būdu nutraukia DNR replikaciją. E. coli chromosoma turi du terminus, vadinamus T 1 ir T 2, esančius apie 100 Kb abiejose pusėse, kur susitiks replikacijos šakės. Kiekvienas galas yra būdingas vienai šakės judėjimo krypčiai.
T 1 ir T 2 yra išdėstyti taip, kad kiekviena šakutė turėtų pereiti kitą, kad pasiektų jam būdingą galą. Replikacijos nutraukimui reikia tus geno produkto, kuris tikriausiai koduoja baltymą, kuris atpažįsta T ir T2.
Eukariotuose kiekviena chromosoma turi keletą replikonų (pvz., Mielių, 500; Drosophila, 3500; pelė 25 000; Viciafaba, 35 000). Bet kuriuo S fazės metu tik keli iš šių replikonų replikuojami; atrodo, kad kiekvienas replikonas yra aktyvuotas tam tikru laiku tam tikroje sekoje. Eukariotinio replikono ilgis gali svyruoti nuo 40 Kb mielių ir Drosophila iki 300 Kb Vicia.
Atrodo, kad aptinkamų replikonų skaičius skiriasi priklausomai nuo vystymosi stadijos ir ląstelės ar audinio tipo. Tai paaiškinama remiantis specifine audinių kilme, kad kai kurie audiniai yra tam tikros kilmės, o kiti - kai kuriuose kituose audiniuose.
Tai parodo Drosophila, kur ankstyvosios embrioninės ląstelės turi 10 kartų daugiau replikonų nei suaugusių somatinių ląstelių. Turimi duomenys rodo, kad eukariotiniai replikonai neturi termino.
Replikacijos patikimumas:
DNR replikacijos klaidų lygis yra daug mažesnis nei transkripcijos, nes reikia išsaugoti genetinės žinios reikšmę iš vienos kartos į kitą. Pavyzdžiui, spontaninis mutacijos greitis E. coli yra apie vieną klaidą per 10 10 bazių, įtrauktų replikacijos metu.
Taip yra visų pirma dėl to, kad yra nedidelių bazių tautomerinių formų, turinčių pasikeitusių bazinių porų savybių. Klaidų lygis sumažinamas įvairiais mechanizmais. DNR polimerazėse bus tik įeinantis nukleotidas, jei jis aktyvioje vietoje sudarys teisingą bazės porą su šablono nukleotidu.
Atsitiktinė klaida aptinkama su 3 '-> 5' korektūros eksonukleaze, susijusia su polimeraze. Tai pašalina neteisingą nukleotidą iš 3'-galo prieš bet kokį tolesnį įterpimą, leidžiant polimerazei įdėti tinkamą bazę. Kad korektūros egzonukleazė tinkamai veiktų, ji turi sugebėti atskirti teisingą bazinę porą iš neteisingo.
Padidėjęs bazinių porų judėjimas „nesurišusių“ bazinių porų, atsiradusių naujai pradėjusių atsiliekančių krypties DNR fragmentų, pabaigoje reiškia, kad jie niekada negali pasirodyti teisingi ir todėl negali būti koreguojami. Taigi, pirmieji keli nukleotidai yra ribonukleotidai (RNR), todėl vėliau jie gali būti identifikuojami kaip mažos ištikimybės medžiaga ir pakeičiami pailginta DNR (ir korektūra) iš gretimų fragmentų. Klaidos, kurios išvengia korektūros, koreguojamos neatitikimo taisymo mechanizmu.
DNR replikacijos mechanizmas prokariotuose:
In vitro DNR replikacija buvo plačiai tiriama E. coli ir E. coli faguose bei plazmiduose. E. coli DNR replikacijos procesas apima tris pagrindinius etapus:
1. DNR replikacijos inicijavimas:
Šis procesas apima tris etapus: i) kilmės (O), (ii) DNR duplekso atidarymo, kad būtų sukurtas viengubos DNR regionas, atpažinimas, ir (iii) Dna B baltymo surinkimas (ty 5 '3' sraigazė taip pat veikia kaip primasės aktyvatorius). Taigi, Dna-A (arba iniciatoriaus baltymas) ATP kompleksas jungiasi prie E. coli ori C 9 bp invertuotų pakartotinių regionų (R,, R, Rv R4) ir skatina DNR duplekso atidarymą trijuose regionuose. tiesioginės 13-bp sekos atkūrimo (vadinamos 13-mers).
Atidarymas vyksta dešiniajame 13-mečių kairiajame kampe ir reikalauja neigiamai superkiltos DNR ir HU arba IHF iniciatoriaus baltymų. Dna B (-elikazė) yra pernešama į ekspresinę vienos grandinės DNR ir sukelia DNR išsiskyrimą, dalyvaujant A TP, SSB baltymams ir DNR girazei (topoizomerazei).
Tai lemia DNR dvipusio atsipalaidavimo procesą ir replikacija iš ori C vyksta abiem kryptimis (dviem kryptimis); SSB surišimas vyksta vienpusiuose regionuose ir du Dna B kompleksai (= primosomai) yra įkeliami po vieną kiekvienai krypčiai.
2. DNR grandinės pailgėjimas:
Šiame etape reikalingi šie fermentai ir veiksniai: 1. Dna B arba helikazė (dar vadinama mobiliuoju promotoriumi); 2. primasė (Dna G); 3. DNR polimerazės holoenzimo (arba DNR pol III HE); 4. SSB baltymas; 5. RNazė H, kuri pašalina RNR pradmenis; 6. DNR polimerazė I, naudojama užpildyti spragą, susidariusią dėl RNR pradmenų ir 7. DNR ligazės (kuri konvertuoja be pagrindo okazakų fragmentus į nepertraukiamą grandinę). Pradedant pailgėjimu, įvyksta šie įvykiai:
(i) Kadangi helikazė (arba Dna B) važiuoja 5 ′ -> 3 ′ kryptimi, ji sukuria replikacijos šakutę atidarydama DNR dvipusį.
(ii) DNR grandinė, turinti helikazę, tampa atsilieka. DNR primasė siejasi su Dna B helikaze, formuodama primorą, kuris sintetina daugelį pradmenų atsiliekančiai grandinei ir vieną RNR pradmenį pirmajai grandinei.
(iii) Atsiliekančios grandinės sintezei DNR pol III HE turi dirbti toje pačioje kryptyje, prie kurios yra susieta Dna B sraigė, tačiau ji važiuoja priešinga kryptimi.
(iii) DnaB helikazė, Dna Gprimase ir DNR pol III FIE kartu veikia pluošto pailgėjimu. Helikazės ir DNR polimerazės agregatai išlieka procesiniai, ty jie lieka sandariai pririšti prie šakės ir lieka siejami visą reakciją.
Atsiliekančių ir pirmaujančių sijų sintezė (- pailgėjimas) vyksta šiek tiek kitaip; tai yra daug sudėtingesnė atsiliekančiai sričiai nei pirmajai sričiai:
A) Atsilikusios grandinės sintezė:
1. Primasas yra paimtas iš tirpalo ir aktyvuojamas helikaze (DnaB), kad sintetizuotų aRNA pradmenį (10-20 nt arba ilgus nukleotidus) atsiliekančioje grandinėje.
2. RNR pradmenys yra atpažįstami DNR pol III HE atsiliekančioje grandinėje ir yra naudojami prekursorių arba okazaki fragmentų sintezei. Tiesą sakant, kiekvienas naujas RNR pradmuo yra atpažįstamas DNR pol III HE gama (y) subvienetu ir pakrautas su tos pačios polimerazės p subvienetu. Tada šis iš anksto įterptas p subvienetas gali užfiksuoti DNR poli III HE šerdį, kai jis tampa prieinamas po to, kai baigia sintetinį darbą ankstesniame okazaki fragmente.
3. Baigus okazaki fragmentus, RNR pradmenis išskiria DNR polimerazė 1, kuri tada užpildo gautas spragas su DNR.
4. Po to, kai DNR polimerazė I prideda galutinį deoksiribonukleotidą į spragą, kurią palieka pašalintas gruntas, fermento DNR ligazė jungia fosfodiesterio jungtį, jungiančią laisvą 3 'galą pradmenų pakeitimo su okazakio fragmento 5' galu.
B) Nuolatinė pagrindinių krypčių sintezė:
1. Dviejų krypčių DNR replikacijos metu pagrindinė grandinė yra gruntuojama vieną kartą kiekvienoje iš tėvų krypčių.
2. Pagrindinės grandinės RNR pradmenis sintezuoja RNR polimerazės fermentas.
3. DNR pol III HE sukelia pirmaujančios krypties pailgėjimą ir galiausiai DNR pol 1 ir ligazės fermentai suteikia galutinį prisilietimą prie pagrindinės krypties, kaip ir atsiliekančios grandinės atveju.
DNR replikacija eukariotuose :
Eukariotinei DNR replikacijai reikia dviejų skirtingų DNR polimerazės fermentų, būtent DNR polimerazės a ir DNR polimerazės δ. DNR polimerazė δ sintezuoja DNR ant pagrindinės krypties (nuolatinė DNR sintezė), o DNR polimerazė a sintezuoja DNR atsiliekančioje grandinėje (nepertraukiama DNR sintezė). Be šių dviejų fermentų, DNR replikacija: (1) T antigenas; (2) replikacijos faktorius A arba RF-A (dar vadinamas RP-A arba eukariotiniu SSB); (3) I topoizomerazė; (4) II topoizomerazė; (5) proliferuojantis - ląstelių branduolinis antigenas (PCNA, taip pat vadinamas cikliniu), ir (6) replikacijos faktorius Cor RF-C.
Eukariotinės DNR replikacijos procesas apima šiuos veiksmus:
1. Prieš prasidedant DNR sintezei, ištirpusio DNR komplekso susidarymo trukmė yra 8-10 minučių. Šiam etapui reikia tik trijų išgrynintų baltymų, būtent T antigeno (T-ag arba naviko antigeno), RF-A ir I ir II topiosomerazių.
2. T-antigenas, naudodamas savo DNR surišimo domeną, su A TP ir su I vieta ir II vieta suformuoja daugialypį subvieneto kompleksą ir sukelia vietinį atsiskyrimą.
3. Didesnis dvipusio atsitraukimo atsiradimas atsiranda dėl RF-A ir topoizomerazės susiejimo su - „T-back Topoisomerases“ DNR helikazės komponento pagalba padeda išardyti DNR, pakeičiant DNR topologiją replikacijos šakute.
4. RF-A arba SSB baltymai prisijungia prie nesuvaržytos vienos grandinės DNR.
5. Pradinė RNR sintezė atliekama primase, kuri yra glaudžiai susijusi su DNR polimeraze ex.
6. DNR polimerazė padeda okazakio fragmento sintezei 5 '- 3' kryptimi.
7. Replikacijos faktorius C (arba RF-C) ir PCNA (ciklinas) padeda perjungti DNR polimerazes taip, kad pol a būtų pakeistas pol 5, kuris tada nuolat sintezavo DNR pirmajame plote.
8. Dar vienas okazaki fragmentas iš poliarizacijos šakutės sintetinamas pola-primase kompleksu ir šis žingsnis kartojamas dar kartą, kol bus padengta visa DNR molekulė.
9. RNR pradmenys pašalinami ir tarpai užpildomi kaip ir prokariotinės DNR replikacijos metu.
Pastaruoju metu buvo pabrėžtas DNR polimerazės e vaidmuo DNR replikacijoje, todėl žinoma, kad trys DNR polimerazės (a, δ ir ε) dalyvauja eukariotinės DNR replikacijos procese. A. Sugino ir bendradarbiai pasiūlė, kad DNR polimerazė a galėtų veikti tiek pirmaujančiose, tiek atsiliekančiose kryptyse (kadangi polimerazė a turi α primasės aktyvumą), o polimerazė e ir polimerazė 5 dalyvauja atitinkamai pirmaujančių ir atsiliekančių krypčių pailgėjime.
DNR žalos ir remonto mechanizmas
DNR pažeidimų tipai:
1. DNR pažeidimai:
DNR normalios cheminės ar fizinės struktūros pokyčiai vadinami DNR pažeidimais. Daugelis eksogeninių agentų, tokių kaip cheminės medžiagos ir spinduliuotė, gali sukelti azoto ir anglies atomų padėties pokyčius bazių heterociklinėse žiedų sistemose ir kai kuriose exociklinėse funkcinėse grupėse (ty bazių keto ir amino grupėse).
Tai gali lemti bazinės poros praradimą arba pakeistą pagrindų poravimą (pvz., Pakeistas A gali remtis C, o ne T). Jei tokiam pažeidimui leidžiama pasilikti DNR, mutacija gali būti fiksuota DNR tiesiogiai ar netiesiogiai.
Alternatyviai, cheminis pokytis gali sukelti fizinį DNR iškraipymą, kuris blokuoja replikaciją ir / arba transkripciją, sukeldamas ląstelių mirtį. Taigi DNR pažeidimai gali būti mutageniniai ir (arba) mirtini. Kai kurie pažeidimai yra spontaniški ir atsiranda dėl būdingo DNR cheminio reaktyvumo ir normalių, reaktyvių cheminių medžiagų buvimo ląstelėje.
Pavyzdžiui, bazinis citozinas patenka į spontanišką hidrolizės dezaminaciją, kad gautų uracilą. Jei paliktas nereaguoti, gautas uracilas sudarytų bazinę porą su adeninu vėlesnės replikacijos metu, sukeldamas taško mutaciją. Nusodinimas yra dar viena savaiminė hidrolizinė reakcija, apimanti N-glikozilinės jungties skilimą tarp N-9 purino bazių A ir G ir C-l 'dezoksiribozės cukraus, taigi ir purino bazių praradimą iš DNR. DNR cukraus-fosfato pagrindas yra nepakitęs. Gauta apurininė vieta yra nekoduojantis pažeidimas, nes prarandama purino bazėse užkoduota informacija.
2. Oksidacinis pažeidimas:
Tai vyksta normaliomis sąlygomis dėl reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) buvimo visose aerobinėse ląstelėse, pavyzdžiui, superoksido, vandenilio peroksido ir, svarbiausia, hidroksilo radikalo (OH). Šis radikalas gali atakuoti DNR I, daugelyje taškų, gamindamas įvairius oksidacijos produktus su pakeistomis II savybėmis, pavyzdžiui, 8-oksoguaninu, 2-oksoadeninu ir 5-formiluracilu. Jų lygį gali padidinti hidroksilo radikalai, atsirandantys dėl jonizuojančiosios spinduliuotės sukeliamos vandens radiolizės.
3. Alkilinimas:
Alkilinimo agentai yra elektrofilinės cheminės medžiagos, kurios lengvai prideda alkilo (pvz., Metilo) grupes į skirtingas nukleorūgščių vietas, kurios skiriasi nuo tų, kurios yra metilintos įprastais fermentiniais fermentais. Dažniausi pavyzdžiai yra metilmetano sulfonatas (MMS) ir etilnitrosurėja (ENU).
Tipiniai metilintų bazių pavyzdžiai yra 7-metilguaninas, 3-metil-adeninas, 3-metilguaninas ir 0-metil-guaninas. Kai kurie iš šių pažeidimų yra galimi mirtini, nes jie gali sutrikdyti DNR atpalaidavimą replikacijos ir transkripcijos metu. Dauguma jų netiesiogiai yra mutageniniai; tačiau 0-6-metilguaninas yra tiesiogiai mutageniškas pažeidimas, nes replikacijos metu jis gali remtis pora su timinu.
4. Daugialypiai priedai:
Ciklobutano pirimidino dimeriai susidaro ultravioletinėje šviesoje iš gretimų pirimidinų vienoje grandinėje, ciklizuojant kiekvienos bazės dvigubą ryšį turinčius C5 ir C6 anglies atomus, kad gautų ciklobutano žiedą. Dėl to prarandamas bazinis poravimas su priešinga kryptis sukelia lokalizuotą DNR denatūraciją, sukeliančią didelį pažeidimą, kuris sutrikdytų replikaciją ir transkripciją. Kitas pirimidino dimero tipas, 6, 4-fotoproduktas, susidaro sujungiant vieną iš pirimidino bazės C6 ir gretimos bazės C4.
Kai kepenų deguto kancerogenas benzo [a] pirenas metabolizuojamas citochromo P-450 kepenyse, vienas iš jo metabolitų (diolio epoksidas) gali kovalentiškai prisijungti prie 2-amino grupės guanino liekanų. Daugelis kitų aromatinių arilinimo agentų sudaro kovalentinius adduktus su DNR. Kepenų kancerogenas aflatoksinas B taip pat kovalentiškai jungiasi su DNR.
DNR taisymas:
Remonto sistemos atpažįsta įvairius DNR pokyčius, kad pradėtų veikti. Ląstelė gali turėti kelias sistemas DNR pažeidimams spręsti. Šios sistemos apima: (1) tiesioginį remontą, (2) ekscizų remontą (3) neatitikties taisymą, (4) tolerančias sistemas ir (5) paieškos sistemas.
1. Tiesioginis remontas:
DNR sugadinimo panaikinimas arba paprastas pašalinimas yra žinomas kaip tiesioginis remontas, pvz., Kovalentinių ryšių tarp dviejų 4 ir dviejų 5 angliavandenių iš dviejų timino liekanų, dalyvaujančių timino dimerų susidaryme, pašalinimas.
Tymino dimeriai paprastai susidaro dėl UV spinduliavimo ir trukdo replikacijai ir transkripcijai. Kelneris (1949) pastebėjo, kad didelis bakterijų skaičius gali išgyventi dideles UV spinduliuotės dozes; jei jie buvo veikiami intensyvaus matomo šviesos šaltinio.
Šis reiškinys vadinamas fotoreaktyvumu. Vėliau buvo įrodyta, kad UV spinduliavimo metu konkretus fermentas yra selektyviai susietas su bakterine DNR. Fotoreakcijos proceso metu fermentas aktyvuojamas matomoje šviesoje. Jis išskleidžia timino dimerus, tokiu būdu atkurdamas jų pradinę formą. Šis remonto procesas yra tarpinis fermentas ir priklausomas nuo šviesos.
2. Ekspedicija:
Šiame remonto mechanizme pažeistas arba pakeistas DNR grandinės segmentas yra išpjautas, o jo vietoje yra susintetintas naujas DNR pleistras. Nors išpjovos taisymo sistemos skiriasi savo specifika, pagrindinis kelias apima šiuos tris etapus:
i) Pripažinimas ir pjūvis:
Sugadintą / pakeistą DNR grandinės dalį atpažįsta endonukleazė; po to šis fermentas nukenčia paveiktą dalį ant abiejų pažeidimo pusių.
ii) Išskyrimas:
5 '-> 3' eksonukleazė (DNR polimerazė I) išskiria pažeistą / pakeistą sekciją; tai duoda dvigubą spiralę regione, kuriame yra dvigubas.
iii) Sintezė:
Šiame etape vienakryptis regionas, gautas išpjaustymo būdu, veikia kaip DNR polimerazės, kuri sintezuoja pašalinto segmento pakeitimą, šablonas. Tada DNR ligazė užsandarina niką, kuris lieka po pakeistos sekcijos sintezės.
E. coli ląstelių išsiskyrimas greičiausiai atsiranda dėl DNR polimerazės I 3 '-> 5 ′ eksonukleazės aktyvumo, o sintezė atliekama naudojant to paties fermento 5' -> 3 'polimerazės aktyvumą. Išmetimo remonto sistemos yra gana įprastos tiek prokariotuose, tiek eukariotuose. Kai kurios iš šių sistemų atpažįsta bendrą DNR žalą, o kitos yra labai specifinės, pvz., AP endonukleazės pašalina ribozės likučius iš depurinacijos vietų. Ekscizų remontas apima skirtingus DNR ilgius ir yra suskirstyti į tris klases:
a) Labai trumpalaikis pataisymas (VSP):
Ši sistema susijusi su neatitikimų tarp konkrečių bazių taisymu.
b) Trumpas pataisymas:
Šioje sistemoje išskiriama apie 20 bazių ilgio DNR grandinė, o pažeidimai pataisomi per E. coli uvr genus (uvr, A, B, C), koduojančius remonto endonukleazės komponentus. Dar vienas fermentas uvr D taip pat reikalingas helikazės aktyvumui.
c) Ilgalaikis pataisymas:
Ši sistema apima apie 1500 bazių ilgo segmento išskyrimą, tačiau kartais pašalintas segmentas gali būti> 9000 bazių. Tai yra daug mažiau paplitęs ir turi būti sukeltas žalos, kuri blokuoja replikaciją. E. coli ši sistema taip pat apima uvr genus ir DNR polimerazę I.
3. Atitikties taisymas:
Tai susiję su neatitikimų taisymu arba susiejimu tarp bazių, kurios nėra viena kitą papildančios. Neatitikimai gali atsirasti (a) replikacijos metu arba (b) dėl bazės pokyčių (pvz., Citozino deaminacija į uracilą) ir struktūriniai dvigubo spiralės DNR spiralės iškraipymai. Šiuos pokyčius E. coli tvarko labai trumpo pleistro pašalinimo sistema, kuri aprašyta žemiau.
E. coli neatitikimo remonto sistema:
Kai bazinėje poroje yra nesuderinamumas, kaip ir GC -> GT, tada teoriškai jis gali pataisyti, kad būtų sukurtas arba laukinis tipas (GC), arba mutantas (AT). Todėl remonto sistema turi atskirti senas ir naujas kryptis ir remontuoti tik naują dalį, kad būtų atkurta laukinė rūšis.
Tai daroma labai trumpo pleistro ištaisymo taisymo sistema ir reikalauja keturių baltymų, būtent Mut L, Mut S, Mut U ir Mut H, koduotų atitinkamai E. coli genų mut L, mut S, mut U ir mut H. replikacijos metu susidariusios pataisos koreguojamos užtvankų remonto sistemoje.
E. coli genų užtvanka gamina metilazę, kuri abiejose DNR grandyse metiluoja GATC sekos adeniną. Visiškai metilintos GATC sekos replikacija duoda hemimetilintą seką, kurioje A liekanos naujai sintezuotose srityse yra ne metilintos.
Netaikoma šio tikslo seka yra naudojama naujai grandinei identifikuoti; bazės aplink nesuderinamumo vietą naujojoje grandinėje yra pašalinamos ir pakeičiamos. Sistema apima genų mut L, mut S, mut H ir uvr D. produktus.
Priėmimo sistemų remontas:
Šios sistemos taip pat žinomos kaip „po replikacijos pataisos“ arba „rekombinacijos taisymas“. E. colyje ši remonto sistema yra pagrįsta rec A genu, kuris gamina RecA baltymą. Rec A baltymas vyksta keičiant kryptis tarp DNR molekulių genetinės rekombinacijos metu ir taip pat veikia vienos eilės mainuose rekombinacijos metu. Atrodo, kad yra du rec A keliai, vienas apima rec B, C genus ir kitą su rec F.
Ši remonto sistema veikia, kai struktūrinis iškraipymas blokuoja replikaciją pažeistoje vietoje. Pavyzdžiui, E. coli mutantai, kurių trūksta ekskremento taisymo, negalės pašalinti timino dimerų. Esant tokiai situacijai, replikacija paprastai vyksta iki sugadintų svetainių; DNR polimerazė sustabdo paveiktos krypties replikaciją ir pakartotinai pakartoja replikaciją, praleidusią praeityje pažeistoje vietoje.
Papildoma kryptis paprastai atkartojama pažeistoje vietoje kitoje kryptyje. Todėl replikacija duoda vieną normalų DNR molekulės palikuonį ir vieną molekulę, turinčią timino dimerį vienoje grandinėje, ir ilgą atotrūkį komplementinėje grandinėje. Palikuonių DNR molekulė su timino dimeriu būtų prarasta, nebent ji būtų pataisyta užpildant spragą vienoje iš jo krypčių.
Tai pasiekiama per vienos grandinės mainus tarp dviejų palikuonių DNR molekulių; mainų regionas užpildo tarpą ir jį sukelia RecA baltymas. Šio pasikeitimo rezultatas, normalus palikuonių molekulė turi vieną gijų regioną, turintį spragą. Šis atotrūkis pataisomas DNR sinteze.
Tolerancijos sistema:
Šiose sistemose sprendžiami nuostoliai, kurie užblokuoja įprastą replikaciją pažeistoje vietoje, galbūt leidžiant pakartotinai sugadinti sugadintas vietas su dideliu klaidų dažnumu. Šios sistemos gali būti ypač svarbios eukariotuose, kur genomo dydis yra labai didelis, todėl visiškai tikėtina, kad žala bus visiškai pašalinta.
