Transgeniniai gyvūnai: genų perdavimo tikslai su skirtingais transfekcijos metodais

Transgeniniai gyvūnai: genų perdavimo tikslai su skirtingais transfekcijos metodais!

Transgeninis gyvūnas genome turi geną arba genus, įvedamus vienu arba kitu transfekcijos būdu.

Transfekcija įvestas genas vadinamas transgenu. Gyvūnų transfekcija nurodo, kad DNR segmentas, plikas arba integruotas į vektorių, įvedamas į gyvūnų ląstelę.

Genų perkėlimo tikslai:

1. Genetiniu gyvūnų modifikavimu gali būti siekiama pagerinti jų pieno, mėsos, vilnos ir kt. Gamybą.

2. Genai buvo perkelti į gyvūnus, kad būtų gauti didelio masto baltymų, koduotų šių genų, gamyba tokių gyvūnų piene, šlapime ar kraujyje.

3. Specialus genų perkėlimo atvejo tikslas - sumažinti arba netgi panaikinti genetinių ligų simptomus ir iš to kylančias kančias. Šiuo požiūriu į pacientą patenka normalios ir funkcinės defektinio geno kopijos (genų terapija).

4. Specialūs eksperimentiniai ir (arba) biomedicinos poreikiai tenkina specifinius transgeninius gyvūnų kamienus arba linijas.

Pertvarkymo metodai:

DNR įvedimui į gyvūnų ląsteles / embrionus buvo naudojami keli būdai:

i) Kalcio fosfato krituliai.

ii) Tiesioginė mikroinjekcija.

(iii) Retrovirusinė infekcija.

(iv) Lipofekcija.

v) dalelių pistoleto pristatymas ir. \ t

vi) Elektroporavimas.

Kalcio fosfato krituliai:

Šiuo požiūriu, transfekcijai naudojamas DNR preparatas iš pradžių ištirpinamas fosfato buferyje. Po to į DNR tirpalą įpilamas kalcio chlorido tirpalas; dėl to susidaro netirpi kalcio fosfatas, kuris kartu su DNR nusodina. Kalcio fosfato-DNR nuosėdos pridedamos prie transfekuojamų ląstelių.

Kietos dalelės į ląsteles patenka į fagocitozę. Iš pradžių šiuo metodu buvo transfekuota 1-2% ląstelių. Tačiau procedūra buvo modifikuota, kad gautų iki 20% ląstelių transfekcijos. Nedidelėje transfekuotų ląstelių dalyje DNR integruojasi į ląstelių genomą, gaunant stabilią arba nuolatinę transfekciją.

Šis bendras požiūris gali būti taikomas beveik visoms žinduolių ląstelėms, o labai daug ląstelių gali būti apdorojamos mažai pastangų. Tačiau daugelis ląstelių linijų nepatinka, kad kalcio fosfato nuosėdos priliptų prie jų paviršių ar jų substrato.

Lipofekcija:

DNR įvedimas į ląsteles naudojant liposomas vadinamas lipofekcija. Liposomos yra mažos pūslelės, paruoštos iš tinkamo lipido. Iš pradžių liposomų gamybai buvo naudojami nejoniniai lipidai, kad DNR turėjo būti įvesta į vezikules po specifinių kapsuliavimo procedūrų.

Katijoninių lipidų panaudojimas liposomų gamybai yra aiškus DNR spontaniškas ir efektyvus kompleksas su šiomis liposomomis, todėl nereikalingos kapsuliavimo procedūros. Katijoninėse liposomose yra viena lipidų dvisluoksnė membrana (unilamellar), ir jie efektyviai jungiasi prie ląstelių. Tikriausiai jie sujungia su plazmos membrana ir taip perduoda DNR (su jais susietą) į ląsteles, kurios sukelia transfekciją.

Lipofekcija yra būdas žinduolių ląstelių transfekcijai in vitro. Jis taip pat buvo naudojamas DNR patekimui į gyvus gyvūnus tiesiogine injekcija arba injekcija į veną. Katijoninės liposomos buvo naudojamos intraveniniam arba intratrachiniam injekcijoms pelėms žymeninių genų ekspresijai plaučiuose. Taip pat įrodyta, kad į liposomų membranas įeina specifiniai ligandų baltymai.

Retrovirusinė infekcija:

Rekombinantiniai retrovirai gamina virionus, kurie naudojami infekuoti gyvūnų ląsteles ir pelių embrionus. Rekombinantinis retroviruso RNR genomas nukopijuojamas atvirkštine transkriptaze, kad gautų DNR kopiją (pajamų transkripciją), kuri tampa integruota į ląstelės genomą. Atvirkštinę transkriptazę koduoja retrovirusas ir jis gaminamas iš karto po infekcijos.

Tačiau atvirkštinė transkripcija gali vykti tik tose ląstelėse, kurios vyksta per S fazę, ty yra mitotiškai aktyvios. Rekombinantinio retroviruso DNR kopija atsitiktinėse vietose integruojasi į ląstelių genomą ir paprastai nėra susijusi su ištrynimu ar pertvarkymu.

Mikroinjektavimas:

Šiuo metodu DNR tirpalas yra įšvirkščiamas tiesiai į ląstelės branduolį arba į apvaisintojo lytinį pronucleus į dviejų ląstelių kiaušialąstę. Paprastai mikroinjekcinė sąranka susideda iš mažos galios stereoskopinio skaidymo mikroskopo (norint pamatyti kiaušialąstę ir visą procesą) ir du mikromanipuliatorius, vieną - stiklo mikropipetę, skirtą kiaušialąstei laikyti daliniu įsiurbimu, o kitą - stiklinę adatą, skirtą stiklo injekcijai. DNR į vyrų pronucleus. Vyriškasis pronucleus yra daug didesnis nei apvaisintų žinduolių kiaušialąstės. Tačiau žuvų kiaušialąstėse DNR švirkščiama į kiaušinių citoplazmą.

Bendra mikroinjekcijos procedūra yra tokia: donorų patelės sukelia super ovuliaciją naudojant atitinkamus hormonų gydymo metodus. Tuomet superovuliuojančios moterys sujungiamos su derlingais vyrais, o daugybė apvaisintų vienos ar dviejų ląstelių kiaušialąstės / embrionai surenkami chirurginiu būdu. Alternatyviai, neperdirbtos kiaušialąstės yra renkamos iš super ovuliarių moterų; tada kiaušialąstės apvaisinamos in vitro. Transgeno konstrukcija yra paruošiama buferiniame tirpale ir įšvirkščiama į apvaisintų kiaušinių vyriškąjį pronuctei mikroinjekcinį mazgą.