Sporų bakterijų dažymas, siekiant diferencijuoti bakterijų sporas ir vegetatyvinę ląstelę

Tikslas:

Visos bakterijos lieka savo „vegetatyvinėmis formomis“, jei aplinkos sąlygos yra palankios normaliai metabolinei veiklai.

Šioje formoje jie užima maistines medžiagas, auga ir dauginasi.

Kita vertus, dauguma jų miršta, kai aplinkos sąlygos tampa nepalankios, pvz., Stiprus šaltas, ekstremalus karštis, senėjimas, maistinių medžiagų trūkumas, radiacijos ir toksiškų cheminių medžiagų poveikis.

Tačiau kai kurios bakterijų rūšys gali išgyventi tokiomis nepalankiomis sąlygomis, keisdamos save labai atspariomis, metaboliškai neaktyviomis formomis, vadinamomis „sporomis“. Nepageidaujamomis sąlygomis sporas gaminamas vegetatyvinėje ląstelėje dehidratuojant ir susitraukiant jo ląstelių turinį.

Šis sporas, susidaręs bakterijų ląstelės viduje, vadinamas „endospore“ (2.13 pav.). Jei pablogėja nepalankios sąlygos, ląstelių plyšimas, išlaisvinantis endosporą, kuris dabar tampa nepriklausoma ramybės ląstelė, vadinama „spore“.

Sporų susidarymo procesas vadinamas „sporogeneze“. Sporos turi storas, santykinai nepralaidžius sluoksnius, tokius kaip sporų žievė ir sporas, kurie apsaugo ląstelę nuo bet kokios fizinės žalos. Sporos pasipriešina keliais mechanizmais, kurie dar nebuvo aiškiai paaiškinti.

Kai sąlygos tampa palankios, sluoksniai, padengiantys sporų plyšimą ir sporas, sukelia metaboliškai aktyvią vegetacinę ląstelę. Šis procesas vadinamas „daigumu“.

Taigi, remiantis gebėjimu sudaryti sporas, bakterijos gali būti suskirstytos į dvi grupes:

(1) Sporas formuojančios bakterijos (sporos formuotojai):

Bakterijos, kurios gali gaminti sporas, kad išgyventų nepalankiomis aplinkos sąlygomis, yra sporas formuojančios bakterijos (sporos). Dažniausiai šios trys lazdelės formos bakterijos gali sukelti sporas nepalankiomis aplinkos sąlygomis.

A. Aerobinės strypo formos bakterijos

1. Bacillus spp.

B. Anaerobinės lazdelės formos bakterijos

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Ne sporų formuojančios bakterijos (ne sporos formuotojai):

Bakterijos, kurios negali gaminti sporų ir dėl to miršta vegetatyvine forma, esant nepalankioms aplinkos sąlygoms, yra ne sporų formuojančios bakterijos (ne sporos).

Sporų dažymo tikslas yra atskirti sporų ir sporų augalines ląsteles ir diferencijuoti sporų formuotojus nuo ne sporų formuotojų. Sporų dažymas taip pat padeda nustatyti bakterijas, priklausančias Bacillus, Clostridium ir Desulfotomaculum gentims.

Principas:

Sporos skiriasi nuo vegetatyvinių ląstelių, nes jose yra storų, santykinai nepralaidžių sluoksnių (2.14 pav.). Pirminis dėmės, žalios spalvos malachitas, per šiuos sluoksnius negali prasiskverbti į sporas.

Todėl pirminės dėmės įsiskverbimą papildo šilumos taikymas, kuris jį perneša per dengiamuosius sluoksnius į sporų protoplastą. Dabar sporos atrodo žalios. Kai sporos yra apdorojamos spalvos šalinimo priemone, vandentiekio vandeniu, jos neišblunka, nes jos išskiria vandenį.

Vandentiekio vanduo pašalina tik sporų aplinkoje esančią pirminę dėmę. Taigi sporos išlaiko žalią spalvą. Vėliau, kai safraninas yra priešpriešinis, safranino molekulės negali patekti į sporas per dengiamuosius sluoksnius. Taigi, galiausiai sporos išlaiko žalią pirminės dėmės spalvą.

Kita vertus, vegetacinių bakterijų ląstelės lengvai užima pirminę dėmę, malachitą, tačiau dėmės nėra stiprios afiniteto vegetatyvinių ląstelių komponentams, dėl kurių jis nuplaunamas, kai jis nuvalomas po vandentiekio vandeniu.

Dabar vegetatyvinės ląstelės atrodo bespalvės. Atspalvis su safraninu, bespalvės vegetatyvinės ląstelės ima dėmę ir atrodo raudonos, priešingai nei sporos, kurios atrodo žalios.

Reikalingos medžiagos:

Pristatymas, kilpa, malachito žalioji, safraninas, sporas formuojančios bakterijos, kaitlentė, mikroskopas, panardinimo alyva.

Procedūra:

1. Slankiklis tinkamai išvalomas po vandentiekio vandeniu, kad vanduo neišliktų ant jo paviršiaus.

2. Prilipęs vanduo nuvalomas bibuliuojančiu popieriumi ir skaidrė džiovinama oru.

3. Sluoksnio centre yra sudarytas dviejų sporų formuojančių bakterijų tepimas, kaip nurodyta toliau.

(a) Jei reikia laikytis sporų, auginamų ant agaro plokštelės ar agaro, reikia įpilti vandens lašo į stiklelio centrą. Cilindras sterilizuojamas per liepsną ir bakterijų Clostridium kilpa iš senosios plokštelės ar šlaito kultūros (48-72 valandos), pavyzdžiui, Clostridium supergenes arba Bacillus subtilis, perkeliama į vandens lašą.

Tuomet, švelniai sukant vandens lašą, gaminama bakterijų suspensija ir lašelis pasklinda, kol gaunamas tepalas. Kadangi sporas formuojančių bakterijų amžius auga ant plokščių ar plokščių kultūrų, jie sudaro sporas.

(b) Jei reikia laikytis sporų, auginamų skystame sultinyje, sultinio kultūra, kurioje yra tik vegetatyvinių ląstelių, yra karšto streso, kaitinant vandens vonioje 15 minučių, kad kai kurios vegetatyvinės ląstelės sudarytų sporas, kad įveiktų šilumos stresas. Mišrių sporų-vegetatyvinių ląstelių suspensijos lašas iš sultinio kultūros tiesiai įstumiamas į stiklelio centrą steriliu kontūru ir ištepamas tepalas.

4. Tepalas išdžiovinamas ore.

5. Tepalas tvirtinamas kaitinant. Šildymas sukelia ląstelių baltymų koaguliaciją, dėl kurių ląstelės prilimpa prie slydimo paviršiaus ir negauna plovimo dažymo metu. Šilumos fiksavimas atliekamas greitai perduodant stiklą aukščiau virš liepsnos 2-3 kartus. paviršius, nukreiptas į viršų, kad tepinėlis nebūtų pašildomas.

6. Tepalas yra užtvindytas pirminiu dažymu, žaliuoju malachitu.

7. Stiklelis laikomas šiltoje karštoje plokštelėje ir preparatas leidžiamas garuoti 2-3 minutes. Karštosios plokštės temperatūra yra sureguliuota taip, kad preparatas nevirtų ir greitai išgaruotų. Garavimo nuostoliai papildomi taip, kad tepinėlis neišdžiūtų.

8. Slankiklis išimamas iš karštojo plokštės ir atvėsinamas.

9. Tepalas išvalomas skalbiant švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu taip, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

10. Tepalas yra užtvindytas priešpriešiniu, safraninu 30 sekundžių.

11. Perviršinis kontrastas visiškai nuplaunamas nuo tepinėlės švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu taip, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

12. Skaidrių popierius nuvalomas sausu popieriumi.

13. Slankiklis yra nukirptas į mikroskopo etapą, o tepinėlis stebimas esant mažai galiai ir dideliems sausiems tikslams.

14. Į tepinėlį įpilama panardinimo alyvos lašas.

15. Tepalas stebimas pagal naftos panardinimo tikslą.