Agrobacterium Mediated Gene Transfer į augalus | Biotechnologija (su diagrama)

Agrobacterium Mediated Gene Transfer augaluose!

Agrobacterium yra gramnegatyvios patogeninės bakterijos, susijusios su augalų rūšių vainikinių formų liga. Kruopų tulžies susidarymas atsiranda dėl to, kad į onkogeninį (vėžį sukeliančią) DNR segmentą perkeliama į augalų ląstelę sužeistose vietose.

Šis DNR segmentas (perkėlimo DNR arba T-DNR) yra bakterijoje esančiame dideliame plazmide, vadinamame Tumorinducing (Ti) plazmidėmis. T-DNR (apie 20 kb ilgio) yra integruota į augalų chromosomą rekombinacijos būdu. Į infekcijos procesą nukreipta serija virulentinių (vir) genų. Taigi, kai sužeistas augalų šaknis arba stiebas, jis atleidžia tam tikrą atsaką.

Atsakydama į tuos signalus, aktyvėja A. gliukozės virusų genai ir nukreipia įvykių seriją, reikalingą T-DNR pernešimui iš Ti plazmidės į augalo chromosomą. Skirtingų virusų genų funkcija apima T-DNR kopiją, po kurios produktas pridedamas prie kopijuotos T-DNR grandinės, kad veiktų kaip lyderis, po to pridedant baltymų kartu su T-DNR ilgiu, galbūt kaip apsauginis mechanizmas.

Tai galiausiai atveria kanalą bakterijų ląstelių membranoje, per kurią eina DNR. T-DNR tada patenka į augalą per žaizdą. Tačiau vis dar nėra aišku, kaip bakterinė DNR perkelia iš citoplazmos į augalo ląstelės branduolį arba kaip T-DNR integruojasi į augalų chromosomas.

Norėdami naudoti šias bakterijas kaip vektorių, jo T-DNR sritis pašalinama, išskyrus pasienio regionus ir vir genus. Tada transgenas įterpiamas tarp T-DNR regionų, kur jis perkeliamas į augalų ląstelę ir tampa integruota į augalo chromosomą (1 pav.). T-DNR yra klonuojama Ti-plazmidėse, kurios yra supjaustytos pagal dydį ir replikuojamos E.coli, kad būtų lengviau atlikti tolesnį manipuliavimą. Šie vektoriai yra mobilizuojami į Agrobacterium šeimininkų padermes ir naudojami užkrėsti augalų audinius.

Šie užkrėsti augalų audiniai vėliau auginami terpėse, kuriose yra specifinių cheminių medžiagų, augimo reguliatoriai, siekiant palengvinti transformuotų ląstelių regeneraciją. Transformantų atranka atliekama esant antibiotikui, esančiam auginimo terpėje. Transformuoti augalai galiausiai analizuojami siekiant stabilios integruotos ir įterptos geno analizės.

„Protoplast Fusion“:

Ląstelės be ląstelės sienos vadinamos protoplastais. Šie protoplastai gali įsisavinti DNR tiesiogiai esant tam tikroms cheminėms medžiagoms (pvz., Polietilenglikoliui, PEG). Didesnė PEG koncentracija sukelia plazmos membranos pralaidumą, o tai leidžia įsisavinti DNR į protoplastus. Net elektriniai signalai gali būti naudojami mažoms skylėms plazminėje membranoje sukurti, einant elektros srovę.

Tai vadinama elektroporacija. Šios mažos angos tada padeda protoplastams įsisavinti DNR. Po to seka ląstelių sienelių susidarymas ir ląstelių dalijimosi pradžia. Tačiau transgeninių augalų gamyba tiesioginiu genų perkėlimu į protoplastus priklauso nuo efektyvios protoplastų sistemos augalų regeneracijai.

„Gene-gun“ arba „Biolistic Gene Transfer“:

Tai naujausias metodas, kuriame galima pristatyti dominančią DNR į ląstelę pakraunant mikroelementus (pvz., Auksą arba volframą) dideliu greičiu. Šis DNR pristatymo procesas vadinamas bombardavimu. Ląstelės viduje DNR molekulės išsiskiria iš dalelių ir galiausiai ši DNR integruojasi į šeimininko ląstelės branduolinį arba organelinį genomą.

Audinių ex-augalai galiausiai auginami terpėse, kuriose yra specifinių hormonų / antibiotikų, norint pasirinkti transformuotus augalus. Kai dominuojantis genas perkeliamas į norimą šeimininką, reikia nustatyti jo stabilią integraciją, kuri atliekama regeneruojant augalus. Tai pasiekiama audinių kultūros metodu.

Audinių kultūros procesas iš esmės gali būti suskirstytas į keturis etapus:

I etapas:

Apima tinkamų tirpalų parinkimą ir perkėlimą į maistinę terpę.

II etapas:

Apima augančio audinio dauginimąsi dauginimo terpėje.

III etapas:

Apima augančio audinio (callus) perkėlimą į terpę, kurioje ji gali atskirti įvairias dalis.

IV etapas:

Apima augalų perkėlimą į natūralią aplinką. Tačiau dominančius genus galima pridėti dviem būdais kaip prasmės ir antisenso orientaciją. Norint išreikšti ar išreikšti geną, genas gali būti įterptas į prasmės orientaciją. Tačiau, jei norime blokuoti nepageidaujamą produktą arba biocheminio kelio etapą, geną galima įdėti į antisensinę orientaciją.